抑制IDOL基因表达的siRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异抑制诱导低密度脂蛋白受体降解蛋白(IDOL)基因表达的siRNA及其用途。所述siRNA可化学合成，也可根据其序列构建成相应的shRNA重组慢病毒或腺相关病毒等。上述siRNA或shRNA重组病毒转染人肝癌细胞HepG2及小鼠肝癌细胞Hepa 1

【技术实现步骤摘要】
抑制IDOL基因表达的siRNA及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种抑制人诱导型低密度脂蛋白受体降解物(IDOL)基因表达的siRNA及其在制备治疗IDOL介导的相关疾病如高血脂症、动脉粥样硬化、心脑血管疾病、肥胖、糖尿病、肾病等病症药物中的应用。

技术介绍

[0002]肝脏的低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein recepter，LDLR)在胆固醇平衡中起到至关重要的作用，LDLR的再循环可增强血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL
‑
C)颗粒的有效清除(Jiang et al.(2015)Atherosclerosis 243:523
‑
32)。诱导低密度脂蛋白受体降解蛋白(inducible degrader of the LDLR，IDOL)是一种主要在肝脏中表达的蛋白，在胆固醇代谢中具有重要作用，可影响肝脏低密度脂蛋白受体(LDLR)水平(Zelcer et al.(2009)Science 325:100
‑
4)。IDOL具有E3泛素连接酶活性，可以介导LDLR的泛素化，并在溶酶体中降解，从而导致肝细胞表面LDLR减少，进而降低肝脏清除LDL
‑
C的能力，最终导致血液中LDL
‑
C水平升高(Calkin et al.(2014)Circ Res 115:442
‑
9；Ibranim et al.(2016)Cardiovasc Res 110:23/>‑
9)。动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是心血管疾病的基础性病变，其发病率高，危害性大，严重威胁人类生命健康(Johnson et al.(2017)Eur J Pharmacol 816:93
‑
106)。
[0003]研究表明，高血浆LDL
‑
C与动脉粥样硬化的发展密切相关，降低血浆LDL
‑
C水平可抑制高脂饮食诱导的动脉粥样硬化发展(Tietge(2014)Curr Opin Lipidol 25:94
‑
5；Rader et al.(2008)Nature 451:904
‑
13)。小鼠体内过表达IDOL可显著提高LDL
‑
C水平并导致动脉粥样硬化(Calkin et al.(2014)Circ Res 115:442
‑
9；Bornfeldt et al.(2018)Am J Pathol 188:343
‑
52)，而抑制IDOL表达或敲除IDOL基因可降低体内LDL
‑
C水平(van Loon et al.(2018)Arterioscler Thromb Vasc Biol 38:1785
‑
95；Hong et al.(2014)Cell Metab 20:910
‑
8)。因此，抑制IDOL可治疗高胆固醇血症及动脉粥样硬化等心血管疾病(Zhang et al.(2016)Med Hypotheses 86:138
‑
42)。此外，IDOL升高与肥胖、代谢紊乱相关(van Loon et al.(2018)Arterioscler Thromb Vasc Biol 38:1785
‑
95)，也与阿尔茨海默病等疾病相关(van Loon et al.(2019)Curr Opin Lipidol 30:192
‑
7)，因此，抑制IDOL表达可成为预防和治疗这些相关性疾病的重要途径。
[0004]目前已有多种RNAi药物处于研发阶段或已获批上市，且显示出很好的治疗效果，研制针对特定疾病靶基因表达的RNAi药物已成为治疗这类疾病的重要途径。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：针对上述现有技术存在的技术问题，本专利技术提供了一种抑制人诱导型低密度脂蛋白受体降解物(IDOL)基因表达的siRNA，还提供了其在制备治疗IDOL介导的相关疾病如高血脂症、动脉粥样硬化、心脑血管疾病、肥胖、糖尿病、肾病等病症药物中的应用。
[0006]技术方案：本专利技术采用生物信息学方法从Genebank获取人、小鼠、大鼠、金黄地鼠及猴的IDOL mRNA序列(RefSeq ID编号依次为NM_013262.4、NM_153789.3、NM_001107344.2、XM_005066339.3和XM_015135555.2)，用DNA man(V6)软件寻找mRNA保守区序列。采用RNA structure分析软件对IDOL mRNA序列的二级结构进行预测，依据siRNA设计原则，综合分析其GC含量、mRNA作用位点的二级结构、siRNA对碱基偏爱性的要求等。在siRNA在线设计软件DSIR设计基础上，进一步寻找合适的siRNA靶序列，初步筛选出10对siRNA序列。再用NCBI GeneBank提供的BLAST软件，选择转录本参考序列数据库(Transcript Reference Sequences)，对上述siRNA序列进行同源分析，排除siRNA非特异性抑制IDOL以外其它基因的可能。
[0007]初步筛选出的10对siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，再通过体外细胞实验筛选出能有效抑制IDOL基因表达的siRNA即si622，所述siRNA序列为：
[0008]正义链：5
’‑
GGAGACUACAACCAGAACAdTdT
‑3’
(SEQ ID NO:7)
[0009]反义链：5
’‑
UGUUCUGGUUGUAGUCUCCdTdT
‑3’
(SEQ ID NO:8)
[0010]所述的抑制IDOL基因表达的siRNA序列3
’
端垂悬有dTdT。
[0011]进一步的，本专利技术根据筛选的si622序列，设计对应的带有环状结构的shDNA序列(SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22)，shDNA序列框架中的loop结构选用TTCAAGAGA，shDNA的转录终止序列采用TTTTTT结构。正义链模板的5
’
端添加了GATCC，反义链模板的5
’
端添加了AATTC，分别与BamHI和EcoR I酶切后形成的粘端互补。
[0012]所述DNA分子序列为：
[0013]正义链：
[0014]5’
GATCCGGAGACTACAACCAGAACATTCAAGAGATGTTCTGGTTGTAGTCTCCTTTTTTG3
’
(SEQ ID NO:21)
[0015]反义链：
[0016]5’
AATTCAAAAAAGGAGACTACAACCAGAACATCTCTTGAATGTTCTGGTTGTAGTCTC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抑制IDOL基因表达的siRNA，其特征在于，所述RNA序列如下：正义链：5
’‑
GGAGACUACAACCAGAACA
‑3’
，即SEQ ID NO:7；反义链：5
’‑
UGUUCUGGUUGUAGUCUCC
‑3’
，即SEQ ID NO:8。2.根据权利要求1所述的抑制IDOL基因表达的siRNA，其特征在于，所述的抑制IDOL基因表达的siRNA序列3
’
端垂悬有dTdT。3.一种编码与权利要求1所述siRNA对应的shRNA的DNA序列，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭树华，王维，张晨曦，陈雪梅，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：