amiRNA-nib2载体在抗小麦黄花叶病中的应用制造技术

本发明专利技术公开了amiRNA

【技术实现步骤摘要】
amiRNA
‑
nib2载体在抗小麦黄花叶病中的应用


[0001]本专利技术属于植物病毒学
，具体是指amiRNA
‑
nib2载体在抗小麦黄花叶病中的应用。

技术介绍

[0002]小麦黄花叶病是小麦上的重要病害，由小麦黄花叶病毒(wheat yellow mosaic virus,WYMV)侵染引起。小麦黄花叶病是我国长江和黄河中下游流域小麦种植区最重要的小麦病毒病，在中国河南、江苏、山东、四川、湖北、陕西、浙江、安徽等9个省份均有报道(Han等,2000；李大伟等,1997),且发病面积和危害日趋严重。据统计，该病一般可引起小麦减产20
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30％，严重时达70
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80％，一些地块甚至绝收(李大伟等，1997)。目前全国发病面积达200万hm2,每年减产1.5xl09kg以上(燕飞等，2013)。利用品种抗病性防治麦类病害是最为经济而有效的重要措施之一。然而，由于禾谷多黏菌传播的小麦病毒一旦传入无病田就很难彻底根除(陈剑平，2005)。近年来植物转基因技术研究迅速发展，通过研究和发展转基因抗病毒小麦品种，能有效的控制病毒的侵染和传播。
[0003]人工合成的amiRNA是通过植物内源miRNA的作用机制来沉默寄主植物的目的基因。miRNA是一类长度约21nt的内源性非编码单链小RNA，通过碱基互补匹配的方式对目的基因的mRNA序列进行切割或抑制其转录后翻译，大多数植物miRNA与靶mRNA以完全互补匹配的方式相结合，进而对靶mRNA的特定位点进行切割而使其降解(王雷，2015)。amiRNA的抗病毒策略以植物内源pre
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miRNA为骨架，将其茎环结构中的miRNA序列替换为与病毒基因互补匹配的amiRNA序列，在保持原始的茎环二级结构基本不变的情况下，pre
‑
amiRNA在植物体内通过内源miRNA合成机制产生靶向病毒mRNA的amiRNA，从而抑制病毒基因表达，达到抗病毒的目。
[0004]利用amiRNA抗病毒策略防治植物病毒病害，可以有效避免脱靶效应(off
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target effects)及重组病毒的产生，具有抗性水平高、稳定性强、安全性高等特点，被认为是第3代抗病毒转基因策略。

技术实现思路

[0005]为了解决上述难题，本专利技术提供了amiRNA
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nib2载体在抗小麦黄花叶病中的应用。
[0006]为了实现上述功能，本专利技术采取的技术方案如下：amiRNA
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nib2载体在抗小麦黄花叶病中的应用，所述amiRNA
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nib2片段的序列如SEQ ID No.1所示。
[0007]进一步地，所述amiRNA
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nib2干扰载体在小麦抗病育种过程中的应用，是指通过人工小RNA技术沉默沉默小麦黄花叶病毒Vpg基因。
[0008]进一步地，所述amiRNA
‑
nib2载体为人工设计小干扰RNA。
[0009]进一步地，所述的病害优选小麦黄花叶病。
[0010]本专利技术采取上述结构取得有益效果如下：本专利技术的amiRNA
‑
nib2载体是人工设计小干扰RNA，是通过内源miRNA(microRNA)的作用机制人为沉默病毒靶基因，该策略稳定有
效且能对多种病毒产生抗性。当通过amiRNA抗病毒策略方法降低该蛋白表达量时可显著降低植物病毒的侵染。因此，该基因可用于解决小麦由于受病毒侵染而导致的产量减少等问题。
附图说明
[0011]图1为本专利技术amiRNA
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nib2载体在抗小麦黄花叶病中的应用的小麦转基因载体示意图；
[0012]图2为本专利技术amiRNA
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nib2载体在抗小麦黄花叶病中的应用的本氏烟瞬时表达amiRNA的表达量分析
[0013]图3为本专利技术amiRNA
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nib2载体在抗小麦黄花叶病中的应用的小麦基因枪转化流程小麦基因枪转化流程图；
[0014]图4为本专利技术amiRNA
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nib2载体在抗小麦黄花叶病中的应用的小麦转基因植株苗期生长状况；
[0015]图5为本专利技术amiRNA
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nib2载体在抗小麦黄花叶病中的应用的转基因小麦成株期植株生长状况；
[0016]图6为本专利技术amiRNA
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nib2载体在抗小麦黄花叶病中的应用的T3代转基因植株PCR检测；
[0017]图7为本专利技术amiRNA
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nib2载体在抗小麦黄花叶病中的应用的Northern检测转基因植株中的amiRNA
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NIb2；
[0018]图8为本专利技术amiRNA
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nib2载体在抗小麦黄花叶病中的应用的amiRNA
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NIb2转基因株系田间鉴定表型。
具体实施方式
[0019]下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0020]在本专利技术的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本专利技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本专利技术的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。以下结合附图，对本专利技术做进一步详细说明。
[0021]如图1
‑
8所述，本专利技术amiRNA
‑
nib2载体在抗小麦黄花叶病中的应用，所述amiRNA
‑
nib2片段的序列如SEQ ID No.1所示。
[0022]所述amiRNA
‑
nib2干扰载体在小麦抗病育种过程中的应用。
[0023]所述amiRNA
‑
nib2载体为人工设计小干扰RNA。
[0024]所述的病害优选小麦黄花叶病。
[0025]实施例1
[0026]1.人工miRNA设计和筛选
[0027]选取周至、扬州、驻马店、山东等地的WYMV基因组各部分序列作为amiRNA作用靶标；选取WYMV基因组内含体蛋白b(Nib)序列作为amiRNA作用靶标；利用人工小RNA技术，模拟miRNA前提在植物体内被剪切这一特性，构建15个amiRNA载体，农杆菌侵染烟草瞬时表达后定量分析，筛选高表达的amiRNAs载体amiRNA
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Nib2载体。
[0028]2.ami本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.amiRNA
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nib2载体在抗小麦黄花叶病中的应用，其特征在于：所述amiRNA
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nib2片段的序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述的amiRNA
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nib2载体在抗小麦黄花叶病中的应用，其特征在于：所述amiRNA
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nib2干扰载体在小麦抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈川，李夏，吴云锋，覃剑锋，陈绪敖，
申请(专利权)人：安康学院，
类型：发明
国别省市：