一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法及其在防治桃蚜中的应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法及其在防治桃蚜中的应用。本发明专利技术确认桃蚜取食植物质体，筛选获得桃蚜RNAi致死基因MpDhc64C之后，构建表达dsMpDhc64C的烟草质体转化载体，转化获得质体转基因烟草。桃蚜取食转基因植物之后目的基因表达水平显著下调，存活率及后代数显著降低，幸存桃蚜体重显著下降，说明植物质体表达的dsRNA成功进入桃蚜体内并引发RNAi效应，进而导致昆虫靶标基因出现下调，引发多种针对桃蚜的不利征状，本发明专利技术显著提高了植物的桃蚜抗性，为桃蚜防治提供了新的技术方案。为桃蚜防治提供了新的技术方案。为桃蚜防治提供了新的技术方案。

【技术实现步骤摘要】
一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法及其在防治桃蚜中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法及其在防治桃蚜 中的应用。

技术介绍

[0002]昆虫类害虫依照口器类型可以划分为咀嚼式害虫和非咀嚼式害虫。许多非咀嚼式害虫都属于半 翅目类昆虫，例如蚜虫，烟粉虱，褐飞虱，盲蝽等，它们中的大部分都是重要的农业害虫，对农业生 产造成极大危害。
[0003]桃蚜是一种属于半翅目蚜科的典型刺吸式害虫，也是世界范围内危害最大的农业害虫之一，其 寄主植物多达400余种，包括桃、李、樱桃、马铃薯、白菜、甘蓝、萝卜、甜椒、芸苔、烟草等许多 重要的经济作物。桃蚜会在外界环境良好的情况下进行无性繁殖，快速扩大种群虫口数，因此少数桃 蚜的感染发生就会导致后续大规模的虫害爆发。桃蚜排泄分泌的蜜露含有大量的糖分，利于有害真菌 孢子的萌发和生长，引发煤污病，最终导致植物光合作用效率下降。在吸取寄主植物韧皮部汁液，争 夺植物营养的同时，桃蚜还能传播100余种植物病毒，其中包括黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃 薯卷叶病毒、烟草蚀纹病毒等，进而引发严重的植物病毒病。因此，植物桃蚜虫害爆发往往还叠加真 菌病害、病毒病害的发生，对农业生产的开展带来了严峻的挑战。
[0004]传统的桃蚜防治主要依赖于各类化学杀虫剂。化学类杀虫剂杀灭桃蚜具有起效快、效果显著的 特点，但同时也面临环境污染、天敌误杀、目标害虫抗性增强等问题。苏云金芽孢杆菌δ
‑
内毒素(Bt 蛋白)转基因植物虽然对鳞翅目、鞘翅目等咀嚼式口器害虫有着良好的抗虫效果，但是对刺吸式害虫 的防治效果则较差，盲蝽类刺吸式害虫甚至成为Bt蛋白转基因棉田里的主要害虫。目前，基于RNAi 基因沉默原理发展起来的抗虫技术已经逐步成熟起来，该类技术有着序列特异性高，环境友好等特点， 为刺吸式害虫的防控提供了新的思路和方向。RNAi是一种广泛存在于真核生物体内，由dsRNA诱发 的基因沉默机制。当dsRNA被吸收进入真核细胞以后，胞内的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成21
‑
24 nt的siRNA，随后siRNA与胞内的AGO蛋白等形成RNA诱导沉默复合体(RISC)，进而对与siRNA 互补的mRNA进行切割，导致靶标mRNA降解，最终诱发基因沉默现象。在害虫防治领域，RNAi 技术通过抑制害虫关键基因的表达，从而实现针对害虫的各种不利征状，如生长迟缓、后代数下降、 体重下降甚至致死等。该技术具有序列特异性，极大减少对作物和人畜的危害，具有较大的应用潜力。
[0005]在过去的十多年里，利用植物介导RNAi技术防治半翅目非咀嚼式害虫方面取得了良好的进展。 2019年，Kanakala等在让烟粉虱取食核转表达靶标烟粉虱Cyclophilin B和Hsp70基因dsRNA的烟 草之后，烟粉虱靶标基因的表达水平出现显著下调，两周内烟粉虱致死率则分别达到了82％和86％。 Liu等在玉米和大豆中成功核转表达了靶标绿盲蝽V
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ATPase
‑
E基因的dsRNA，绿盲蝽在取食两种转基 因植物之后，致死率在一周内均达到了
60％以上。Sun等通过核转成功获得了表达靶标麦长管蚜SaZFP 基因dsRNA的转基因小麦，取食转基因小麦的蚜虫在九天内死亡率超过了40％。针对桃蚜的植物介 导RNAi研究同样成果颇丰。2015年，Coleman等在拟南芥中核转表达了靶标桃蚜C002基因的dsRNA， 与对照组相比，取食转基因拟南芥的桃蚜种群虫口数下降了60％。2018年，Bhatia等发现桃蚜在取食 了表达靶标桃蚜表皮蛋白基因dsRNA的转基因拟南芥之后，蚜虫后代数减少了近40％。
[0006]近年来，利用植物质体介导RNAi抗虫技术在防治马铃薯甲虫方面取得了理想的结果， 取食dsRNA质转植物的马铃薯甲虫幼虫在5天内死亡率达到了100％。质体是一种植物特有 的细胞器，是前质体、叶绿体、白色体、造粉体等质体的总称。其中叶绿体是植物进行光合 作用的重要场所，质体基因组相对而言比较小(150kb左右)，主要负责编码光合作用、转录 翻译等相关基因。质体基因组还具有明显的原核细胞表达特征，例如基因成簇排列、多顺反 子序列共表达等。质体基因工程技术兴起于上世纪90年代初，该技术首先在烟草当中取得了 成功。与传统的植物细胞核转化不同，质体转化采用了同源重组的方式，利用基因枪轰击， 将外源基因整合到质体基因组特定位点中。利用aadA作为植物再生过程中的抗性筛选标记 基因，使得质体转化效率得到了极大提高。相比于传统的核转化技术，质体转化技术具有如 下优势：
①
外源基因表达量高。质体基因组在植物细胞内以多拷贝的形式存在，一个成熟的 叶肉细胞中质体基因组拷贝数可达1900
‑
5000份，使得外源目的基因可以进行超量表达；
②ꢀ
多基因共转化。质体基因组结构及表达模式与原核生物类似，质体基因组规模小，便于遗传 操作，可以实现多基因共同表达；
③
环境安全性高。大多数被子植物质体遗传为母系遗传方 式，转化植物的花粉(雄配子)中不含转基因成份，转基因序列不会随花粉传播，杜绝了转 基因植物花粉田间扩散的风险，利于生态稳定；
④
质体基因表达无基因沉默现象。质转过程 中，外源基因通过同源重组而定点整合到质体基因组特定位置中，没有T
‑
DNA随机插入而 引发的基因表达位置效应。由于质体基因的表达不存在甲基化、乙酰化、组蛋白修饰等表观 遗传学调控，不产生基因沉默现象，外源基因可以在质体转基因系统中均一表达；
⑤
基因表 达产物区域化。质体具有完整的内膜与外膜屏障，目的基因表达产物区域化在质体体内，因 此高水平的基因表达产物对于植物其它部位的生理功能的影响较小。尽管核转植物核介导的 RNAi技术在防治桃蚜等半翅目非咀嚼式害虫方面取得了大量进展，但半翅目非咀嚼式害虫

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法及其在 防治桃蚜中的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
[0008]本专利技术以桃蚜和烟草为主要研究对象，通过dsRNA人工饲料饲喂法筛选出了桃蚜有效RNAi靶 标致死基因MpDhc64C，在此基础之上构建了表达dsMpDhc64C的烟草质转载体，通过基因枪法获得 了表达dsMpDhc64C的质转烟草植株。本专利技术筛选获得了一种全新的桃蚜RNAi致死基因MpDhc64C， 对表达dsMpDhc64C的质转植物进行了桃蚜抗性评估，发现dsRNA质转烟草植物对于桃蚜具有显著 的抗性，为植物介导RNAi防治桃蚜等半翅目非咀嚼式害虫提供了新的技术路线。
[0009]本专利技术是这样实现的，一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法，通过质体转
化技术将表达桃 蚜Dhc64C基因dsRNA的质转表达质粒转化至植物中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法，其特征在于：通过质体转化技术将表达桃蚜Dhc64C基因dsRNA的质转表达质粒转化至植物中。2.根据权利要求1所述的一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法，其特征在于：所述桃蚜Dhc64C基因dsRNA通过将SEQ ID NO：1所示序列和其反向互补序列通过马铃薯intron
‑
loop序列连接表达获得。3.根据权利要求1所述的一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法，其特征在于：所述马铃薯intron
‑
loop序列如SEQ ID NO：17所示。4.根据权利要求1所述的一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法，其特征在于：将桃蚜Dhc64C基因dsRNA连接至抗性质粒pYY12中，再通过质体转化技术转化至植物中。5.根据权利要求1所述的一种防治桃蚜的质体转基因植物的制备方法，其特征在于，表达桃蚜Dhc64C基因dsRNA的质转表达质粒的制备方法包括：以桃蚜cDNA为模板，分别以引物对SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8进行PCR扩增，得到Dhc64C
‑1st
(XhoI/BglII)片段和Dhc64C
‑2nd
(NotI/BamHI)片段；将Dhc64C
‑1st
(XhoI/BglII)片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：张江，董毅，张琪，杨勇，王子灿，常玲，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：