本公开提供一种重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，其包括步骤1重组微纤溶酶原（Microplasminogen）的纯化，步骤2微纤溶酶原的激活，以及步骤3微纤溶酶（Microplasmin）的纯化。其中所述步骤1重组微纤溶酶原的纯化包括MMC层析、PHE疏水层析；所述步骤2微纤溶酶原的激活采用尿激酶将微纤溶酶原转化为微纤溶酶；所述步骤3微纤溶酶的纯化包括Benzamidine亲和层析、SP阳离子交换层析、超滤浓缩。通过对各步骤的条件优化和参数选择使所述方法获得的终产品微纤溶酶纯度达到97％以上，得率20％左右，且易于工业放大。且易于工业放大。且易于工业放大。
【技术实现步骤摘要】
重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺
[0001]本专利技术属于生物制药领域，具体涉及一种重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，特别是涉及针对酵母重组表达的截短型人微纤溶酶原的纯化、激活以及截短型人微纤溶酶的纯化方法。
技术介绍
[0002]玻璃体黄斑粘连（VMA）是指玻璃体发生不完全后脱离（PVD）时，部分玻璃体及其后皮质与黄斑部发生的粘连，持续存在的VMA可导致玻璃体黄斑牵引综合征（VMT）、特发性黄斑裂孔、糖尿病性黄斑水肿等一系列黄斑部的病理改变。越来越多的研究表明VMA与渗出型AMD密切相关，手术去除VMA对渗出型AMD可起到一定的治疗效果，可见VMA可能在渗出型AMD发病机制中起着一定的作用。近年研究发现，VMA在渗出型AMD中的发生率为27.8～36.0%，明显高于在非渗出型AMD及正常人中的发生率，其差异有统计学意义。另外还有研究发现，光动力疗法及抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)治疗失败的渗出型AMD眼常合并VMA。
[0003]Jetrea (ocriplasmin)是一种重组截断的人纤维蛋白溶酶（GW005是Jetrea的生物类似药），分子量27.2 kDa，可降解眼中参与VMA发生的蛋白质（玻璃体和玻璃体视网膜界面VRI蛋白组分，如层粘连蛋白[laminin]、纤维连接蛋白[fibronectin]和胶原），这些蛋白质的降解有助于玻璃体与黄斑的分离。Jetrea分别于2012年10月17日和2013年3月15日获得FDA和欧盟批准用于治疗VMA和玻璃体黄斑牵引（VMT），即VMA。该病的另一种治疗选择是玻璃体切除术。
[0004]结合抗VEGF
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A抗体药物在AMD等眼底疾病治疗的效果，除应用于VMA外，GW005还可辅助应用于抗VEGF
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A抗体治疗效果不佳的AMD和DR患者。目前VMA通常采用玻璃体切除的治疗手段，作为VMA的特效治疗药物，伴随OCT等诊断技术的进步以及玻璃体注射方式的普及应用，相信GW005的市场容量还将进一步扩大。
技术实现思路
[0005]本公开提供一种重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，其包括步骤1重组微纤溶酶原（Microplasminogen）的纯化，步骤2微纤溶酶原的激活，以及步骤3微纤溶酶（Microplasmin）的纯化。其中所述步骤1重组微纤溶酶原的纯化包括MMC层析、PHE疏水层析；所述步骤2微纤溶酶原的激活采用尿激酶将微纤溶酶原转化为微纤溶酶；所述步骤3微纤溶酶的纯化包括Benzamidine亲和层析、SP阳离子交换层析、超滤浓缩。通过对各步骤的条件优化和参数选择使所述方法获得的终产品微纤溶酶纯度达到97％以上，得率20％左右，且易于工业放大。
[0006]具体而言：一方面，本专利技术提供一种重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，其包括：步骤1重组微纤溶酶原（Microplasminogen）的纯化；步骤2微纤溶酶原的激活；
步骤3微纤溶酶（Microplasmin）的纯化；其中，步骤2采用尿激酶将纯化的重组微纤溶酶原激活为微纤溶酶，所述纯化的重组微纤溶酶原与尿激酶的比例为4
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8μg/U，在10
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30℃下反应10
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20min，调节pH值至酸性终止激活反应。
[0007]进一步，本专利技术所述重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，其特征在于：步骤2中纯化的重组微纤溶酶原的浓度为3
‑
6mg/mL，所述重组微纤溶酶原激活是在低离子强度近中性的溶液体系中进行。
[0008]进一步，本专利技术所述重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，其特征在于：步骤2重组微纤溶酶原的激活是在10mmol/L Tris
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HClpH7.2
‑
7.5的溶液体系中，20℃激活10min，激活完成后添加柠檬酸至pH3.0左右终止反应。
[0009]进一步，本专利技术所述重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，其中步骤1包括步骤1.1 MMC层析：采用Bestarose Diamond MMC填料，用纯化水将酶原发酵液稀释至电导9.0
±
0.5mS/cm，调pH至7.0
±
0.1，控制上样载量20～25mg/ml，用含500mmol/L NaCl、20mmol/L PB、pH7.0的洗脱液洗脱，收集重组微纤溶酶原。
[0010]进一步，本专利技术所述重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，其中步骤1还包括步骤1.2 PHE疏水层析：采用Phenyl High Performance填料，以pH7.2、25mmol/L PB为基础缓冲液、用硫酸铵调节电导至125～130mS/cm作为平衡缓冲液；向步骤1.1收集的重组微纤溶酶原中添加硫酸铵固体调电导至125～130mS/cm，控制上样载量10～15mg/ml；以pH7.2、25mmol/L PB为洗脱缓冲液，采用45%洗脱缓冲液的梯度洗脱重组微纤溶酶原。
[0011]进一步，本专利技术所述重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，其中步骤1还可以包括步骤1.3 G25脱盐：将步骤1.2 PHE疏水层析洗脱获得的重组微纤溶酶原的溶液体系置换为低离子强度近中性的溶液体系。
[0012]进一步，本专利技术所述重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，其中步骤3包括步骤3.1Benzamidine亲和层析：采用Benzamidine Bestarose 4 FF亲和填料，以含80mmol/L NaCl、10mmol/L 氨甲环酸、pH7.5、20mmol/L PB作为平衡缓冲液；向步骤2激活的微纤溶酶中添加NaCl调节电导10
±
1mS/cm，添加氨甲环酸固体至10mmol/L，调节pH值至7.5
±
0.1，控制上样载量12～15mg/ml；以含500mmol/L 氨甲环酸、pH7.5、25mmol/L PB作为洗脱缓冲液，采用20%洗脱缓冲液梯度预洗除去结合较弱的杂蛋白，用60%洗脱缓冲液梯度洗脱目的蛋白，收集的洗脱峰需立即用1mol/L的柠檬酸母液调节pH值至3.5以下。
[0013]进一步，本专利技术所述重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，其中步骤3包括步骤3.2 SP阳离子交换层析：使用Sepharose SP FastFlow阳离子交换层析填料，以pH 3.2～3.3、电导38～40mS/cm的缓冲液作为平衡缓冲液；
向步骤3.1获得的洗脱液中加入NaCl调节电导至38～40mS/cm，调pH值至3.2～3.3，控制上样载量9～15mg/ml；以含1mol/L NaCl的缓冲液与平衡缓冲液按照35%的洗脱液梯度洗脱目的蛋白。
[0014]进一步，本专利技术所述重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，其中步骤3还可以包括步骤3.3超滤浓缩：使用切向流超滤法将步骤3.2洗脱的目的蛋白浓缩至3.0
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4.0mg/mL，并将缓冲液置换为pH3.1、5mmol/L的柠檬酸盐缓冲液。
[0015]另一方面，本专利技术提本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，其包括：步骤1重组微纤溶酶原（Microplasminogen）的纯化；步骤2微纤溶酶原的激活；步骤3微纤溶酶（Microplasmin）的纯化；其中，步骤2采用尿激酶将纯化的重组微纤溶酶原激活为微纤溶酶，所述纯化的重组微纤溶酶原与尿激酶的比例为4
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8μg/U，在10
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30℃下反应10
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20min，调节pH值至酸性终止激活反应。2.如权利要求1所述重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，其特征在于：步骤2中纯化的重组微纤溶酶原的浓度为3
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6mg/mL，所述重组微纤溶酶原激活是在低离子强度近中性的溶液体系中进行。3.如权利要求1所述重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，其特征在于：步骤2重组微纤溶酶原的激活是在10mmol/L Tris
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HCl pH7.2
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7.5的溶液体系中，20℃激活10min，激活完成后添加柠檬酸至pH3.0左右终止反应。4.如权利要求1所述重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，其中步骤1包括步骤1.1 MMC层析：采用Bestarose Diamond MMC填料，用纯化水将酶原发酵液稀释至电导9.0
±
0.5mS/cm，调pH至7.0
±
0.1，控制上样载量20～25mg/ml，用含500mmol/L NaCl、20mmol/L PB、pH7.0的洗脱液洗脱，收集重组微纤溶酶原。5.如权利要求4所述重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺，其中步骤1还包括步骤1.2 PHE疏水层析：采用Phenyl High Performance填料，以pH7.2、25mmol/L PB为基础缓冲液、用硫酸铵调节电导至125～130mS/cm作为平衡缓冲液；向步骤1.1收集的重组微纤溶酶原中添加硫酸铵固体调电导至125～130mS/cm，控制上样载量10～15mg/ml；以pH7.2、25mmol/L PB为洗脱缓冲液，采用45%洗脱缓冲...
【专利技术属性】
技术研发人员：梅菲，陆游，范敏，于东安，谭小钉，郭帅利，田赵源，游猛，付珍珍，
申请(专利权)人：江苏迈威康新药研发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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