一种用于检测胃癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测胃癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法，核酸组合物，包括：Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，RNF180基因目的位点的甲基化特异性引物，CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物，RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针ACTB内参基因的特异性引物和探针；本发明专利技术发现的核酸组合物配置成的试剂盒具有检测检测胃癌相关基因甲基化结果准确、时效性快，检测通量高、特异性好、敏感性好等优点。敏感性好等优点。敏感性好等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测胃癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，特别是一种用于检测胃癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]胃癌(胃癌，GC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一。世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布了2020年全球最新癌症统计数据：每年约有109万例新发病例，77万例死亡病例。其中，中国的发病和死亡例数均占全球近一半，分别为48万例和37万例。研究显示，胃癌患者5年生存率与介入时期密切相关，中晚期胃癌的5年生存率约20％，早期患者的5年生存率高于70％。因此提升胃癌早期诊断和筛查水平，对于控制胃癌人群增长、延长患者生存期和提高生存质量均有重要意义。
[0003]胃镜是目前诊断胃癌最为常用的工具。结合切片病理分析，胃镜检查可发现早期胃癌黏膜改变，但仍存在IIb型早期胃癌难发现，活检准确取材成功率不稳定导致误诊风险等问题。且胃镜依从性较差，70％的受检人会因其侵入性产生恐惧、紧张和焦虑情绪，所以多数患者不愿意接受胃镜检查。而由于操作人员经验不足或设备清洁不当导致的上消化道损伤和交叉感染的情况也时有报道。蛋白标志物可以作为胃癌诊断的参考依据，常用的胃癌蛋白标志物包括CEA、CA19
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9、CA50和胃蛋白酶原等。但是，由于这些常规胃癌蛋白标志物的敏感性/特异性不够高，不适合被单独用作胃癌的诊断依据，对早期胃癌检测更是作用十分有限。综上，寻找具有较高灵敏度和特异性的胃癌标志物，从而更加准确及时地对胃癌做出早期诊断，对胃癌患者具有十分重要的意义。
[0004]随着技术上的快速发展，肿瘤分子标志物发展成为继影像诊断、病理诊断之后的肿瘤诊断治疗新的领域，对肿瘤的诊断、监测和治疗产生了重大影响。肿瘤分子标志物可以在体液或组织中检测到，能够反映肿瘤的存在、分化程度、预后估计和判断治疗效果等。目前，随着基因诊断技术不断发展，给胃癌的早期诊断带来了希望，其中一个领域就是甲基化DNA检测。DNA异常甲基化几乎在所有肿瘤中都有发生，使其成为肿瘤诊断的一个可靠靶标。DNA异常甲基化是肿瘤发生的一个早期事件，在疾病确诊前就能被检测出来。此外，DNA异常甲基化的“成簇”性推动液体活检进入肿瘤早筛。因此，甲基化成为肿瘤早期诊断、患病风险预测、临床病程监控和疗效评估的最有希望的潜在指标。
[0005]Septin 9基因定位于染色体17q25.3位置，Septin 9基因有18个转录本，涉及肌动蛋白动力学、血管生成、细胞迁移、细胞增殖、细胞形状和细胞分裂等多种细胞生理学过程。最近有研究指出，该基因与胃癌、乳腺癌、卵巢癌、白血病和淋巴瘤等的发生紧密相关。SEPT9(Septin 9)基因是参与胞质分裂和细胞周期控制的Septin家族的成员，参与形成丝状细胞骨架GTP酶，可能在胞质分裂中发挥作用，属于肿瘤抑制基因。SEPT9基因有18个转录本，涉及肌动蛋白动力学、血管生成、细胞迁移、细胞增殖、细胞形状和细胞分裂等多种细胞生理学过程。。
[0006]RNF180(Ring Finger Protein 180)基因编码的蛋白质是一种DNA修复蛋白质，参与细胞防御诱变和烷基化剂毒性的防御。该蛋白质催化DNA从O(6)
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烷基鸟嘌呤和DNA的其他甲基化部分向其自身分子的甲基转移，从而修复了毒性损伤。其相关途径包括DNA损伤逆转和染色质调节/乙酰化。RNF180基因启动子甲基化的改变会导致基因活性的降低，与多种癌症类型有关，包括结肠直肠癌，肺癌，淋巴瘤和成胶质细胞瘤，少突胶质瘤等胶质瘤。
[0007]Runx3基因被认为是一个新的抑癌基因，属人Runt相关转录因子(human runt
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related transcription factor，RUNX)家族成员，是TCF
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B信号传导通路中的一个重要环节。RUNX3基因在胃粘膜生长调控中起重要作用，能抵抗TCF
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B诱导的生长抑制和细胞凋亡，调控胃粘膜上皮细胞分化，其失活可导致胃粘膜上皮细胞的肠化生，并可由此导致胃癌的发生、发展和转移。
[0008]CDKN2A(Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 2A，P16)基因家族及其相关因子所组成的庞大调控体系是细胞周期最关键的调节通路之一，与其他正负调控因子协调合作，决定着细胞周期的正常运转和细胞增殖、分化、老化及调亡，并与多种人类肿瘤的发生、发展、治疗与预后密切相关。在大多数情况下，CDKN2A通过纯合缺失而失活。CDKN2A可能发生失活的机制之一是该基因启动子区域的甲基化。、
[0009]目前，胃癌甲基化早期检测仍然无法找到一种结果准确、时效性快，检测通量高、特异性好、敏感性好的核酸组合物和试剂盒，本专利技术解决这样的问题，能够间接为人胃癌的早期诊断提供有效的信息，为胃癌的早发现早治疗以及治疗效果监控提供一种简便易行的方法。

技术实现思路

[0010]为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于检测胃癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法，本专利技术发现的核酸组合物配置成的试剂盒具有检测检测胃癌相关基因甲基化结果准确、时效性快，检测通量高、特异性好、敏感性好等优点。
[0011]为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：
[0012]一种用于检测胃癌相关基因甲基化的核酸组合物，包括：Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，RNF180基因目的位点的甲基化特异性引物，CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物，RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针ACTB内参基因的特异性引物和探针；
[0013]Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
[0014]正向引物：5＇
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CGCATTCGTTTTTATTAG
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3＇SEQ ID 01，
[0015]反向引物：5＇
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CACCTCGAAATCCAAA
‑
3＇SEQ ID 02，
[0016]检测探针：5＇标记物
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CGCGTAACCGCGAAATCCGCATAAT
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3＇标记物SEQ ID 03，
[0017]RNF180基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：
[0018]正向引物：5＇
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GGGTTGTAGTATAGTTCGGCG
‑
3＇SEQ ID 04，
[0019]反向引物：5＇
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CCAAACCTAAAAACTCGCACGACT
‑
3＇SEQ ID 05，
[0020]检测探针：5＇标记物
‑
TTTCTTTCGTCGAATCGGTTCGTCGTCGTC
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3＇标记物SEQ ID 06，CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测胃癌相关基因甲基化的核酸组合物，其特征在于，包括：Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，RNF180基因目的位点的甲基化特异性引物，CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物，RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针ACTB内参基因的特异性引物和探针；所述Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：正向引物：5＇
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CGCATTCGTTTTTATTAG
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3＇SEQ ID 01，反向引物：5＇
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CACCTCGAAATCCAAA
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3＇SEQ ID 02，检测探针：5＇标记物
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CGCGTAACCGCGAAATCCGCATAAT
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3＇标记物SEQ ID 03，所述RNF180基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：正向引物：5＇
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GGGTTGTAGTATAGTTCGGCG
‑
3＇SEQ ID 04，反向引物：5＇
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CCAAACCTAAAAACTCGCACGACT
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3＇SEQ ID 05，检测探针：5＇标记物
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TTTCTTTCGTCGAATCGGTTCGTCGTCGTC
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3＇标记物SEQ ID 06，所述CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：正向引物：5＇
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ACGTGTGAGCGGTGTTC
‑
3＇SEQ ID 07，反向引物：5＇
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TACCAAGCTAACTCTAACGAA
‑
3＇SEQ ID 08，检测探针：5＇标记物
‑
CTCCGACTAATACCCCGAAA
‑
3＇标记物SEQ ID 09，所述RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：正向引物：5＇
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TTCGCGGAGAGGTTTTATGT
‑
3＇SEQ ID 10，反向引物：5＇
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CGACAAAACGCCTTCGTAA
‑
3＇SEQ ID 11，检测探针：5＇标记物
‑
AGTTTGGGTTTTCGAGAGTTTGGGAGTTCG
‑
3＇标记物SEQ ID 12，所述ACTB内参基因特异性引物和探针包括：正向引物：5＇
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GTGATGGGGAGGTTTATAAGTT
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3＇SEQ ID 13，反向引物：5＇
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GCACTCTCCGAAAAGAAACG
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3＇SEQ ID 14，检测探针：5＇标记物
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ACCACCCCCAACACACAAAACAAACACA
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3＇标记物SEQ ID 15。2.一种用于检测胃癌相关基因甲基化的试剂盒，其特征在于，包括：PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品和无模板对照；PCR反应液包括：Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，RNF180基因目的位点的甲基化特异性引物，CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物，RUNX3基因目的位点的甲基化特异性引物和探针ACTB内参基因的特异性引物和探针，2X PCR buffer，dNTP，无核酸酶水，基因组DNA样本，Taq酶；所述Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：正向引物：5＇
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CGCATTCGTTTTTATTAG
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3＇SEQ ID 01，反向引物：5＇
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CACCTCGAAATCCAAA
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3＇SEQ ID 02，检测探针：5＇标记物
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3＇标记物SEQ ID 03，所述RNF180基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：正向引物：5＇
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3＇SEQ ID 04，反向引物：5＇
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CCAAACCTAAAAACTCGCACGACT
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3＇SEQ ID 05，检测探针：5＇标记物
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3＇标记物SEQ ID 06，所述CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：正向引物：5＇
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反向引物：5＇
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3＇标记物SEQ ID 12，所述ACTB内参基因特异性引物和探针包括：正向引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷红仓，钱飞箭，王云飞，车仙荣，
申请(专利权)人：杭州圣庭医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：