一种分枝杆菌和真菌基因特异性引物组及分枝杆菌和真菌感染的测序方法技术

本发明专利技术公开一种分枝杆菌和真菌基因特异性引物组，包括特异性基因IS6100、hsp65、rpoB、gyrA、L1A1、RPB1、Tub2、CaM、URA5、CAP10、mtLSU、Kex

【技术实现步骤摘要】
者RPB1的引物组包含具有SEQ11所示的核苷酸序列和包含具有SEQ12所示的核苷酸序列； 或者Tub2的引物组包含具有SEQ13所示的核苷酸序列和包含具有SEQ14所示的核苷酸序列； 或者CaM的引物组包含具有SEQ15所示的核苷酸序列和包含具有SEQ16所示的核苷酸序列； 或者URA5的引物组包含具有SEQ17所示的核苷酸序列和包含具有SEQ18所示的核苷酸序 列；或者CAP10的引物组包含具有SEQ19所示的核苷酸序列和包含具有SEQ20所示的核苷 酸序列；或者mtLSU的引物组包含具有SEQ21所示的核苷酸序列和包含具有SEQ20所示的 核苷酸序列；或者Kex
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1的引物组包含具有SEQ23所示的核苷酸序列和包含具有SEQ24所 示的核苷酸序列；或者MP1引物组包含具有SEQ25所示的核苷酸序列和包含具有SEQ26所 示的核苷酸序列。
[0006]作为优选，所述分枝杆菌包括结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，所述非结核分枝杆菌 包括：鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌。
[0007]作为优选，所述真菌包括念珠菌和曲霉菌。
[0008]作为优选，所述念珠菌包括白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌。
[0009]作为优选，所述曲霉菌包括烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉；隐球菌包括格特隐球 菌、新型隐球菌、马尔尼菲蓝状菌、耶氏肺孢子菌。
[0010]本专利技术还公开了一种利用分枝杆菌和真菌基因特异性引物组以检测分枝杆菌和真菌感 染的测序方法，包括以下步骤：
>[0011]1)设计覆盖分枝杆菌特异性分型基因IS6100、hsp65、rpoB、gyrA引物；覆盖念珠菌 特异性分型基因L1A1、RPB1引物；
[0012]2)在各个正向引物
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F的5
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端加上TTTCTGTTGGTGCTGATATTG碱基填充序列，各 个反向引物
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R的5
’
端加上ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC碱基填充序列，得到含有第二 轮PCR引物结合位点的扩增引物；
[0013]3)将第二轮PCR引物结合位点的扩增引物稀释，混合各基因的正反向引物；其次将混 合后的引物形成引物池；
[0014]4)合成适用于第二轮PCR的Barcode标签引物，将所有barcode干粉引物稀释，并将 相同barcode的正反向引物混合，形成barcode引物池。
[0015]作为优选，还包括步骤5)，所述步骤5)为提取基因组DNA。
[0016]作为优选，还包括步骤6)，所述步骤6)为用引物池进行第一轮扩增并纯化。
[0017]作为优选，还包括步骤7)，所述步骤7)为用Barcode引物进行第二轮扩增并纯化。
[0018]作为优选，还包括步骤8)，所述步骤8)为构建测序文库并纯化。
[0019]本专利技术的有益效果是：(1)专利技术具有简便、快速、全面、准确等优点，有利于指导临 床对于结核病、非结核病以及侵袭性真菌感染的区分。(2)本专利技术利用多重PCR技术将待测 病原菌靶基因在一个反应中进行扩增，结合纳米孔测序平台对特异性基因扩增子进行高通量 检测，可同时检测出6种分枝杆菌和11种真菌。
附图说明
[0020]图1是本专利技术的文库构建流程示意图；
[0021]图2是4个阳性样本和1例阴性质控在经过二轮扩增后的琼脂糖凝胶电泳胶图；
[0022]图3是4个不同结核分枝杆菌拷贝数样本的qPCR鉴定图谱。
[0023]图中其中NC代表的是水。
具体实施方式
[0024]下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步的描述。
[0025]实施例1：1)设计覆盖6种分枝杆菌(包括结核分枝杆菌；非结核分枝杆菌包括：鸟 分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌，但不仅限于上述 非结核分枝杆菌)和12种真菌(念珠菌包括：白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平 滑念珠菌，但不仅限；曲霉菌包括：烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉，但不仅限；隐球菌 包括：格特隐球菌、新型隐球菌；马尔尼菲蓝状菌；耶氏肺孢子菌)特异性基因IS6100、hsp65、 rpoB、gyrA、L1A1、RPB1、Tub2、CaM、URA5、CAP10、mtLSU、Kex
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1、MP1引物，具 体引物序列信息见表1。
[0026]表1.分枝杆菌和真菌基因特异性引物表1.分枝杆菌和真菌基因特异性引物
[0026]2)在各个正向引物
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F的5
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端加上TTTCTGTTGGTGCTGATATTG碱基填充序列，各 个反向引物
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R的5
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端加上ACTTGCCTGTCGCTCTATCTTC碱基填充序列，得到含有第二 轮PCR引物结合位点的扩增引物，具体引物序列见表2。
[0027]表2.结核分枝杆菌耐药相关基因扩增引物
[0028]3)将上述表2中所有引物稀释至100μM，等比例混合各基因的正反向引物；其次将混 合后的引物形成引物池，引物池中IS6100、hsp65、rpoB、gyrA、L1A1、RPB1、Tub2、CaM、 URA5、CAP10、mtLSU、Kex
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1、MP1对应的引物浓度比例为0.5：1：1.2：1：0.9：1.5：1： 1.2:1.5：1：0.8：1.2:1。虽然不同比例的引物混合也可实现本专利技术结果，但是此种比例混合是 一种优选。
[0029]4)合成适用于第二轮PCR的Barcode标签引物，每个Barcode引物对应一个样本，使 每个样本带有不同的Barcode标签。将所有barcode干粉引物稀释到10μM，并将相同barcode 的正反向引物等比例混合，形成barcode引物池。具体引物序列见表3。
[0030]表3.barcode引物信息表 引物名称引物序列(5'
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3')引物序列barcode01
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FGGTGCTGAAGAAAGTTGTCGGTGTCTTTGTGTTAACCTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCSEQ53barcode01
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RGGTGCTGAAGAAAGTTGTCGGTGTCTTTGTGTTAACCTACTTGCCTGTCGCTCTATCTTSEQ54barcode02
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FGGTGCTGTCGATTCCGTTTGTAGTCGTCTGTTTAACCTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCSEQ55barcode02
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RGGTGCTGTCGATTCCGTTTGTAGTCGTCTGTTTAACCTACTTGCCTGTCGCTCTATCTTSEQ56barcode03
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FGGTGCTGGAGTCTTGTGTCCCAGTTACCAGGTTAACCTTTCTGTTGGTG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分枝杆菌和真菌基因特异性引物组，其特征是，包括特异性基因IS6100、hsp65、rpoB、gyrA、L1A1、RPB1、Tub2、CaM、URA5、CAP10、mtLSU、Kex
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1或MP1引物组，其中，IS6100的引物序列包含具有SEQ01所示的核苷酸序列和包含具有SEQ02所示的核苷酸序列；或者hsp65的引物组包含具有SEQ03所示的核苷酸序列和包含具有SEQ04所示的核苷酸序列；或者rpoB的引物组包含具有SEQ05所示的核苷酸序列和包含具有SEQ06所示的核苷酸序列；或者gyrA的引物组包含具有SEQ07所示的核苷酸序列和包含具有SEQ08所示的核苷酸序列；或者L1A1的引物组包含具有SEQ09所示的核苷酸序列和包含具有SEQ10所示的核苷酸序列；或者RPB1的引物组包含具有SEQ11所示的核苷酸序列和包含具有SEQ12所示的核苷酸序列；或者Tub2的引物组包含具有SEQ13所示的核苷酸序列和包含具有SEQ14所示的核苷酸序列；或者CaM的引物组包含具有SEQ15所示的核苷酸序列和包含具有SEQ16所示的核苷酸序列；或者URA5的引物组包含具有SEQ17所示的核苷酸序列和包含具有SEQ18所示的核苷酸序列；或者CAP10的引物组包含具有SEQ19所示的核苷酸序列和包含具有SEQ20所示的核苷酸序列；或者mtLSU的引物组包含具有SEQ21所示的核苷酸序列和包含具有SEQ20所示的核苷酸序列；或者Kex
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1的引物组包含具有SEQ23所示的核苷酸序列和包含具有SEQ24所示的核苷酸序列；或者MP1引物组包含具有SEQ25所示的核苷酸序列和包含具有SEQ26所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的一种分枝杆菌和真菌基因特异性引物组，其特征是，所述分枝杆菌包括结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，所述非结核分枝杆菌包括：鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌。3.根据权利要求1所述的一种分枝杆菌和真菌基因特异性引物组，其特征是，所述真菌包括念珠菌和曲霉菌。4.根据权利要求3所述的一种分枝杆菌和真菌基因特...

【专利技术属性】
技术研发人员：逄宇，许佩松，王云飞，谷红仓，李姗姗，任卫聪，
申请(专利权)人：杭州圣庭医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：