【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学，尤其涉及一种肺癌循环肿瘤细胞的处理方法、试剂及其应用。
技术介绍
1、循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，ctcs)是从原发肿瘤或转移灶脱落后释放入外周循环血液中具有特殊性状的肿瘤细胞，其通过内渗和外渗作用造成实质性转移，并且在转移的过程中会发生表面标志物的变化，从而形成转移灶的关键环节。近年来，随着液体活检技术兴起，ctcs检测研究逐渐成为当前肿瘤研究的热点和焦点，因其包含有关癌症的遗传和分子信息，并且其中存在的基因突变与原发性肿瘤之间是高度一致的。不仅能揭示肿瘤发生和转移的潜在机制，而且为癌症的早期诊断、疗效评估、预后评价和药物治疗监测等方面显示出重要的价值，这也是原发性肿瘤检测所达不到的。因此，ctcs不但可以反映肿瘤组织的状况，而且还能作为活检样本的替代品，用于病理诊断、疾病监测和分子测序。
2、目前，ctcs的可靠检测主要取决于有效的细胞分离与鉴别，即应用免疫磁珠阴性富集及免疫荧光原位杂交技术检测。阴性富集法是获取血液中的稀有细胞，通过磁场进行富集肿瘤细胞，利用免疫磁珠与非肿瘤细胞结合，使其停留在磁场中。由于部分肿瘤细胞不表达特异性抗原，阳性富集法会出现假阴性的结果，而采用的阴性富集法则避免了这一缺陷，具有更高的检出率。荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，fish)是将分子生物探针与染色体特定位点结合来检测染色体异常的一门新兴的分子细胞遗传学技术，原理是用已知的标记单链核酸为探针，与待检样本中未知的单链核酸
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供一种肺癌循环肿瘤细胞的处理方法，所述处理方法是通过cd45抗体磁珠负向富集循环肿瘤细胞，再联合cep8、cep10和alk融合探针实现的。
2、进一步地，所述处理方法的具体步骤如下：
3、(1)去除外周血中的血红蛋白；
4、(2)裂解红细胞；
5、(3)磁珠与白细胞结合：在处理样本中添加预处理液c，室温孵育，加入1×预处理液a，混匀、离心，弃去上清液，加入1×预处理液a重悬细胞，再添加预处理液d，混匀，室温孵育，加入1×预处理液a，混匀；
6、(4)去除白细胞；
7、(5)涂片；
8、(6)固定；
9、(7)脱水；
10、(8)杂交孵育：与cep8、cep10和alk融合基因探针杂交；
11、(9)洗涤；
12、(10)再次孵育：加入抗人cd45抗体；
13、(11)洗涤；
14、(12)复染；
15、(13)阅片。
16、更进一步地，所述步骤(3)中，在350-450μl处理样本中添加35-45μl预处理液c，室温孵育，加入1×预处理液a至3.5-4.5ml，混匀、离心，弃去上清液，加入1×预处理液a重悬细胞至350-450μl，再添加35-45μl预处理液d，混匀，室温孵育，加入1×预处理液a至2-3ml，混匀。
17、更进一步地，所述步骤(3)中，在400μl处理样本中添加40μl预处理液c，室温孵育，加入1×预处理液a至4ml，混匀、离心，弃去上清液，加入1×预处理液a重悬细胞至400μl，再添加40μl预处理液d，混匀，室温孵育，加入1×预处理液a至2.5ml，混匀。
18、本专利技术的目的之二在于提供cd45抗体磁珠以及cep8、cep10和alk融合探针在制备肺癌循环肿瘤细胞处理试剂中的应用。
19、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
20、本专利技术通过阴性富集ctcs和三种探针的协同作用，大幅度提高了对肺癌ctc的检出率，当单独使用8号染色体着丝粒探针(cep8)时，检测肺癌ctcs的灵敏度为47.1％(8/17)，特异性为87.5％(21/24)，而联合三种探针同时检测时，对肺癌ctc检测灵敏度(16/17，94.1％)却显著提高，并且还保持了特异性的不变。因此，三联探针的检测方法通过准确捕获ctcs荧光信号提高了检出率，也增加了肺癌ctcs的检测灵敏度，使其能够实现快速、灵敏的临床检测，使医生更加了解肺癌患者的实时状态，为临床治疗方案的制定带来帮助。
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1.一种肺癌循环肿瘤细胞的处理方法，其特征在于，所述处理方法是通过CD45抗体磁珠负向富集循环肿瘤细胞，再联合CEP8、CEP10和ALK融合探针实现的。
2.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述处理方法的具体步骤如下：
3.根据权利要求2所述的处理方法，其特征在于，所述步骤(3)中，在350-450μl处理样本中添加35-45μl预处理液C，室温孵育，加入1×预处理液A至3.5-4.5ml，混匀、离心，弃去上清液，加入1×预处理液A重悬细胞至350-450μl，再添加35-45μl预处理液D，混匀，室温孵育，加入1×预处理液A至2-3ml，混匀。
4.根据权利要求3所述的处理方法，其特征在于，所述步骤(3)中，在400μl处理样本中添加40μl预处理液C，室温孵育，加入1×预处理液A至4ml，混匀、离心，弃去上清液，加入1×预处理液A重悬细胞至400μl，再添加40μl预处理液D，混匀，室温孵育，加入1×预处理液A至2.5ml，混匀。
5.CD45抗体磁珠以及CEP8、CEP10和ALK融合探针在制备肺癌循环肿瘤细胞处理
...【技术特征摘要】
1.一种肺癌循环肿瘤细胞的处理方法，其特征在于，所述处理方法是通过cd45抗体磁珠负向富集循环肿瘤细胞，再联合cep8、cep10和alk融合探针实现的。
2.根据权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述处理方法的具体步骤如下：
3.根据权利要求2所述的处理方法，其特征在于，所述步骤(3)中，在350-450μl处理样本中添加35-45μl预处理液c，室温孵育，加入1×预处理液a至3.5-4.5ml，混匀、离心，弃去上清液，加入1×预处理液a重悬细胞至350-450μl，再...
【专利技术属性】
技术研发人员：谷红仓，孔繁平，刘海姿，高丽，王云飞，车仙荣，
申请(专利权)人：杭州圣庭医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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