一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，属于分子生物学领域，本发明专利技术包括如下步骤：步骤一，设计结核分枝杆菌插入序列IS6110、hsp65、rpoB、16S rRNA、gyrB基因待测区域的特异性引物；步骤二，得到含有特定碱基序列的引物并混合形成引物池；步骤三，合成Barcode引物；步骤四，提取基因组DNA；步骤五，第一轮扩增并纯化；步骤六，第二轮扩增并纯化；步骤七，构建测序文库并纯化；步骤八，使用纳米测序仪测序，对数据进行质控分析后，进行数据分析；本发明专利技术通过找到这5种靶基因组合的扩增引物，使扩增序列能对分枝杆菌不同菌种进行鉴定区分，实现快速、准确、灵敏的鉴定分歧杆菌。菌。菌。

【技术实现步骤摘要】
一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，特别是一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法。

技术介绍

[0002]结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起人类结核病的主要病原菌。结核病是威胁人类健康的重要公共卫生问题之一，是全球各大死因中重要原因。非结核分枝杆菌（NTM）与MTB同属于分枝杆菌属，有少部分可引起人类感染（如鸟胞内分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌等），NTM感染可以具有与结核病相似的临床表现，近年来NTM感染有逐渐增加的趋势。因此对于两者的菌种鉴定对于临床诊断与治疗具有重要意义；根据以上市场需求，本司研究了以下技术。
[0003]多重聚合酶链式反应（Multiplex PCR）技术，是在一个反应体系中加入两对以上的引物，达到同时扩增出多个核酸片段的目的。
[0004]分子诊断技术具备灵敏度高、特异性好、周期短等诸多优点。目前已广泛用于MTB病原学检测以及分枝杆菌菌种鉴定。其主要原理是以分枝杆菌相关基因作为标志物，完成对标本中是否含有分枝杆菌核酸的检测。
[0005]纳米孔测序技术，可以通过扩增子富集DNA（cDNA）目标序列、加接头、制备文库测序。利用接头上的马达蛋白解旋DNA双链，并牵引单链分子穿过固定在电阻膜上的纳米孔蛋白，不同的碱基会形成特征性离子电流变化信号。纳米孔测序仪再将这种电信号转化为化学信号，最终获得DNA序列。
[0006]市场需要找到几种靶基因组合的扩增引物，使扩增序列能对分枝杆菌不同菌种进行鉴定区分，将纳米孔测序技术与多重PCR相结合，设计建库测序方法，能够快速、准确、灵敏的检测，本专利技术解决这样的问题。

技术实现思路

[0007]为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，本专利技术通过找到IS6110、hsp65、rpoB、16S rRNA、gyrB基因这5种靶基因组合的扩增引物，使扩增序列能对分枝杆菌不同菌种进行鉴定区分，再配合纳米孔测序技术与多重PCR相结合，实现快速、准确、灵敏的鉴定分歧杆菌。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，包括如下步骤：步骤一，设计结核分枝杆菌插入序列IS6110、hsp65、rpoB、16S rRNA、gyrB基因待测区域的特异性引物MTB
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IS6110
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F、MTB
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IS6110
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R，MTB
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hsp65
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F、MTB
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hsp65
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R，MTB
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rpoB
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F、MTB
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rpoB
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R，MTB
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16s
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F、MTB
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16s
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R，MTB
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gyrB
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F、MTB
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gyrB
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R；扩增产物为427
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533 bp；步骤二，在正向引物的5
’
端加上AGGTCTTCACGATACGTCGAG碱基序列，在反向引物的5
’
端加上GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG碱基序列，得到含有特定碱基序列的引物Nano
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MTB
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IS6110
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F、Nano
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MTB
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IS6110
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R，Nano
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MTB
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hsp65
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F、Nano
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MTB
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hsp65
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R，Nano
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MTB
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rpoB
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F、Nano
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MTB
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rpoB
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R，Nano
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MTB
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16s
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F、Nano
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MTB
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16s
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R，Nano
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MTB
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gyrB
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F、Nano
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MTB
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gyrB
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R；合成这些含有特定碱基序列的引物，将Nano
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MTB
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IS6110
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F、Nano
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MTB
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IS6110
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R，Nano
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MTB
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hsp65
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F、Nano
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MTB
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hsp65
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R，Nano
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MTB
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rpoB
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F、Nano
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MTB
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rpoB
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R，Nano
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MTB
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16s
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F、Nano
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MTB
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16s
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R，Nano
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MTB
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gyrB
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F、Nano
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MTB
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gyrB
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R这五对引物混合，形成引物池；步骤三，合成Barcode 引物，每个Barcode引物对应一个样本，使每个样本带有不同的Barcode标签；步骤四，提取基因组DNA；步骤五，用引物池进行第一轮扩增并纯化；步骤六，用Barcode引物进行第二轮扩增并纯化；步骤七，构建测序文库并纯化；步骤八，使用纳米测序仪测序，对数据进行质控分析后，进行数据分析。
[0009]前述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，步骤二中的引物MTB
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IS6110
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F、MTB
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IS6110
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R、MTB
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hsp65
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F、MTB
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hsp65
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R、MTB
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rpoB
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F、MTB
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rpoB
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R、MTB
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16s
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F、MTB
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16s
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R、MTB
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gyrB
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F、MTB
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gyrB
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R的序列分别是：SEQ01、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
℃保存；纯化采用磁珠纯化。6.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，其特征在于，步骤六中第二轮扩增反应包括：2
×
PCR mix 25μl，Barcode引物 2μl，第一轮扩增纯化后产物23μl；反应程序为：95 ℃ 预变性5min；95 ℃变性15 s ，62 ℃退火15s，72 ℃延伸30s，12个循环；循环结束后72 ℃延伸5min，4 ℃保存；纯化采用磁珠纯化。7.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的分枝杆菌快速鉴定方法，其特征在于，步骤七中构建测序文库并纯化的具体方法包括：（1）pooling：将第二次扩增后的纯化产物进行pooling；（2）末端修复、加A尾：总体系为：pooling完的DNA溶液50μl，末端修复mix 15μl；反应程序为：20 ℃ 反应15min，65 ℃终止反应 15min，4 ℃保存；（3）末端修复进行磁珠纯化；（4）接头连接的总体系为：末端修复纯化后产物25μl，5
×
连接缓冲液 10μl，DNA连接酶 5μl，Adapter Mix 1μl，ddH2O9μl；反应程序为，20 ℃ 反应15min，4 ℃保存；（5）将接头连接产物进行磁珠纯化后得到终文库；（6）...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷红仓，陶春豪，许佩松，王云飞，车仙荣，
申请(专利权)人：杭州圣庭医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：