一种适用于产孢真菌快速鉴定植物病原菌种类的方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于产孢真菌快速鉴定植物病原菌种类的方法，涉及分子生物学鉴定技术领域，包括以下步骤：S1.样本收集与处理：从发病植物上采集新鲜病害症状典型且带有产孢病原物的样本，然后从采集的样本中选取带有产孢病原物样本进行杀菌；S2.病原菌孢子收集：使用步骤S1中产孢病原物样本制备孢子悬浮液；S3.PCR反应：采用真菌孢子悬浮液进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物片段大小；S4.测序分析确定病原菌种类：将步骤S3中目的片段进行测序，得到的DNA序列在NCBI上进行Blast对比，从而确定导致植物真菌病害的病原菌种类。的病原菌种类。的病原菌种类。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于产孢真菌快速鉴定植物病原菌种类的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学鉴定
，具体涉及一种适用于产孢真菌快速鉴定植物病原菌种类的方法。

技术介绍

[0002]植物真菌病害的发生和流行常常引起产品的质量下降和产量损失，最终导致经济效益下降。因此，对植物真菌病害病原菌及时准确的鉴定，是采取有效防控措施的重要前提。目前，对病原菌的鉴定主要是通过病症的诊断、病原菌分离培养、科赫氏法则验证，再对病原菌进行分离、形态学观察等，最终确定病原菌种类。对真菌病害除了常规的直接形态学观察鉴定外，为了更准确的了解病害病原菌信息，通常采用真菌的通用PCR引物对其基因组核糖体DNA内转录间隔区(ITS)进行扩增，将得到ITS序列进行分析。
[0003]但采用ITS
‑
PCR方法对病原菌进行鉴定前，首先要对病原菌进行分离纯化、菌丝培养、菌丝收集研磨，再采用CTAB或SDS法提取菌丝DNA，最终得到真菌DNA。将得到的DNA进行PCR扩增、回收目的片段等一系列复杂过程。现有的方法中，真菌分离纯化困难、培养时间长且需要的菌丝量多，对活体寄生难以分离培养的病原菌很难进一步鉴定，真菌基因组DNA提取时间长、耗费试剂和人力成本高，有些试剂(如氯仿、巯基乙醇、丙酮)本身对实验操作者的身体健康有危害，PCR扩增产物需经过纯化，链接克隆载体、转化等步骤才能测序分析。这些缺点极大的限制了田间植物病害病原菌的快速鉴定，贻误了病害的最佳防治时期。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于：解决现有技术中鉴定过程复杂、耗时长，且有些试剂本身危害实验操作者的身体健康等技术问题。
[0005]本专利技术的技术方案如下：
[0006]一种适用于产孢真菌快速鉴定植物病原菌种类的方法，包括以下步骤：
[0007]S1.样本收集与处理：从发病植物上采集新鲜病害症状典型且带有产孢病原物的样本，然后从采集的样本中选取带有产孢病原物样本进行杀菌；
[0008]S2.病原菌孢子收集：使用步骤S1中产孢病原物样本制备孢子悬浮液，所述孢子悬浮液作为后续PCR反应中的DNA模板；
[0009]S3.PCR反应：采用真菌通用引物ITS4和ITS5对步骤S2中的孢子悬浮液进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物片段大小；
[0010]S4.测序分析确定病原菌种类：将步骤S3中目的片段进行测序，得到的DNA序列在NCBI上进行Blast对比，从而确定导致植物真菌病害的病原菌种类。
[0011]进一步的，所述步骤S1中新鲜病害症状典型且带有产孢病原物的样本为：霉状物、霜霉状物、粉状物、球状物、锈状物、棉絮状物、絮状物、丝状物、颗粒状物或点状物。
[0012]进一步的，所述步骤S1中新鲜病害症状为发病后出现孢子2
‑
3d。
[0013]进一步的，所述步骤S1中新鲜病害症状典型且带有产孢病原物的样本采集后于4
℃保存，备用。
[0014]进一步的，所述步骤S1中杀菌为使用紫外灯杀菌20
‑
30min。
[0015]进一步的，步骤S2中孢子悬浮液制备方法为，用无菌解剖针挑起样本表面的孢子于EP管中，加入50
‑
100ml无菌水，在振荡器上震荡3
‑
5min。
[0016]进一步的，所述EP管为1.5ml EP管。
[0017]进一步的，所述步骤S3中PCR扩增体系为：ITS4引物和ITS5引物各2.5ul、孢子悬浮液5
‑
6ul、2
×
Taq Master Mix 25ul，再用ddH2O补足到50ul。
[0018]进一步的，所述步骤S3中PCR扩增条件为：96
‑
97℃预变性6
‑
8min，96
‑
97℃变性40
‑
50s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35
‑
40个循环；72℃终延伸5
‑
8min。
[0019]进一步的，所述步骤S4中的测序结果对比确定病原菌种类的方法为：将测序结果在NCBI上进行Blast对比，匹配长度最长，序列相似率达99％
‑
100％的真菌被判定为被鉴定植物病原菌所属真菌。
[0020]与现有的技术相比本专利技术的有益效果是：
[0021]1、本专利技术直接采用病原菌孢子制作成孢子悬浮液作为PCR扩增的DNA模板，为植物病原真菌的分子鉴定提供了一种有效的可行的分子技术途径；
[0022]2、本专利技术提供了一种快速鉴定产孢植物病原真菌种类的方法，能在短时间内鉴定出病原菌种类，为有效有针对性地开展植物真菌病害的防治，及时解决农作物、经济作物、蔬菜、果树等植物的真菌病害问题提供了强有力的技术支持。
附图说明
[0023]图1为本专利技术水稻稻曲病病原菌孢子PCR产物的琼脂糖电泳结果图；
[0024]图2为本专利技术李子褐腐病病原菌孢子PCR产物的琼脂糖电泳结果图；
[0025]图3为本专利技术重楼灰霉病病原菌孢子PCR产物的琼脂糖电泳结果图；
[0026]图4为本专利技术对比例1的电泳结果图；
[0027]图5为本专利技术对比例2的电泳结果图；
[0028]图6为本专利技术对比例3的电泳结果图；
[0029]图7为本专利技术对比例4的电泳结果图；
[0030]图8为本专利技术对比例5的电泳结果图；
[0031]图9为本专利技术对比例6的电泳结果图；
[0032]图10为本专利技术对比例7的电泳结果图；
[0033]图11为本专利技术对比例8的电泳结果图。
具体实施方式
[0034]下面结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述。
[0035]实施例一
[0036]一种适用于产孢真菌快速鉴定水稻稻曲病病原菌种类的方法，包括以下步骤：
[0037](1)水稻稻曲病病原菌样本收集与处理：从水稻上采集新鲜的球状物(稻曲球)样本，于4℃保存、备用。从采集的样本中选取孢子粉覆盖厚度大于1mm的稻曲球放在超净工作台上，用紫外灯杀菌20min。
[0038](2)稻曲病病原菌孢子收集：用无菌解剖针挑起稻曲球表面的孢子于1.5ml EP管中，加入50ml无菌水，在振荡器上震荡3min，其孢子悬浮液作为下一步的PCR反应中的DNA模板。
[0039](3)PCR反应：采用真菌通用引物ITS4和ITS5对的稻曲病病原菌孢子悬浮液进行PCR扩增。PCR扩增体系为：ITS4引物和ITS5引物各2.5ul、模板(孢子悬浮液)5ul、2
×
Taq Master Mix 25ul，再用ddH2O补足到50ul。
[0040]PCR扩增条件为：96℃预变性8min，96℃变性50s，55℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环；72℃终延伸5min。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于产孢真菌快速鉴定植物病原菌种类的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.样本收集与处理：从发病植物上采集新鲜病害症状典型且带有产孢病原物的样本，然后从采集的样本中选取带有产孢病原物样本进行杀菌；S2.病原菌孢子收集：使用步骤S1中产孢病原物样本制备孢子悬浮液，所述孢子悬浮液作为后续PCR反应中的DNA模板；S3.PCR反应：采用真菌通用引物ITS4和ITS5对步骤S2中的孢子悬浮液进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物片段大小；S4.测序分析确定病原菌种类：将步骤S3中目的片段进行测序，得到的DNA序列在NCBI上进行Blast对比，从而确定导致植物真菌病害的病原菌种类。2.根据权利要求1所述的一种适用于产孢真菌快速鉴定植物病原菌种类的方法，其特征在于，所述步骤S1中新鲜病害症状典型且带有产孢病原物的样本为：霉状物、霜霉状物、粉状物、球状物、锈状物、棉絮状物、絮状物、丝状物、颗粒状物或点状物。3.根据权利要求1所述的一种适用于产孢真菌快速鉴定植物病原菌种类的方法，其特征在于，所述步骤S1中新鲜病害症状典型且带有产孢病原物的样本采集后于4℃保存，备用。4.根据权利要求1所述的一种适用于产孢真菌快速鉴定植物病原菌种类的方法，其特征在于，所述步骤S1中杀菌为使用紫外灯杀菌20
‑
30min。5.根据权利要求1所述的一种适用于产孢真菌快速鉴定植物病原菌种类的方法，其特征在于，步骤S2中孢子悬浮液制备方法为，用无菌解剖针挑...

【专利技术属性】
技术研发人员：伏荣桃，卢代华，陈诚，王剑，向运佳，赵黎宇，陈雪娟，
申请(专利权)人：四川省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：