一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术提供一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法、试剂盒及其应用，属于代谢物检测技术领域。所述方法包括：基于LC

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于代谢物检测
，具体涉及同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一种含硫氨基酸，主要是在甲硫氨酸(methionine，Met)代谢过程中生成的，在体内的代谢途径有3种：
①
同型半胱氨酸与丝氨酸在胱硫醚β合成酶催化下，以维生素B6为辅酶，生成胱硫醚，胱硫醚在胱硫醚γ裂合酶作用下，最终生成半胱氨酸(cysteine，Cys)；
②
同型半胱氨酸在亚甲基四氢叶酸还原酶的作用下，以维生素B12为辅酶，以甲基四氢叶酸为甲基供体，甲基化生成甲硫氨酸；
③
同型半胱氨酸直接释放到细胞外液。由以上代谢途径可知，影响同型半胱氨酸代谢的因素有很多，包括前体物质、酶、辅助因子等，这些在同型半胱氨酸代谢通路上的必需因子通过影响代谢途径从而可能导致同型半胱氨酸在血中蓄积，形成高同型半胱氨酸血症。比如，在第2种代谢途径中，正常生理情况下，同型半胱氨酸经过一系列酶的参与及辅助，最终代谢为甲硫氨酸，如果代谢辅酶维生素B12缺乏，会使同型半胱氨酸代谢受阻，在血中浓度升高，从而形成高同型半胱氨酸血症，对人体造成一定的损伤。
[0004]我国高同型半胱氨酸血症发病率较高，其中轻度患者的发病率占正常人群的5％
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7％。同型半胱氨酸血症与心血管疾病、高血压、脑卒中、慢性肾脏病、肿瘤、痴呆等疾病的发生发展均有一定的关联性，可作为这些疾病的独立危险指标或重要危险指标，也可用于人体健康风险评估。据流行病学调查表明，我国成人血中同型半胱氨酸水平均值为13
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14μmol/L，男性高于女性，而美国人群血中同型半胱氨酸水平均值为9.4μmol/L，我国人群要高出40％
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50％，可见我国人群同型半胱氨酸水普遍处于较高水平。Hcy含量与遗传因素、营养因素、年龄性别、疾病以及药物使用等因素有关，如Hcy代谢途径上控制5
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甲基四氢叶酸还原酶活性的MTHFR基因如果发生突变，则酶活性会降低或失活，可导致代谢通路受阻，血中Hcy蓄积，导致高同型半胱氨酸血症；体内Hcy水平与微量营养素的摄入有关，血中维生素B6、维生素B12摄入不足，其Hcy水平越高，尤其我国烹饪习惯造成的日常维生素缺乏现象很普遍，是我国人群Hcy平均水平高于美国的原因之一；据研究，年龄的增长与血Hcy水平呈正相关，男性普遍高于女性，这可能与内分泌激素有关。这些影响因素是预防或治疗高同型半胱氨酸血症的重要突破口。
[0005]由上述可知，在一种或多种因素的影响下，人体Hcy升高，使得细胞、组织及器官发生病变，从而对人体健康造成严重影响。Hcy升高是人体代谢异常的结果，代谢通路上涉及的7种重要代谢物包括同型半胱氨酸、叶酸、5
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甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素
B12、半胱氨酸，它们的含量变化，可在一定程度上反应Hcy水平的变化，把它们作为检测指标，通过检测并控制这些代谢物处于合适的水平范围内，可有效预防疾病发生或控制高同型半胱氨酸血症病情发展。在2020年《高同型半胱氨酸血症诊疗专家共识》中指出，推荐开展与同型半胱氨酸相关的检测指标，以明确同型半胱氨酸升高的原因，进而指导临床精准干预治疗，实现有效预防和精准医疗的目的。因此，仅检测同型半胱氨酸一项指标，已不能满足目前临床需求，需要多种指标联合检测，对Hcy代谢通路上各代谢物进行综合评估，科学指导临床制订个体化诊疗方案，对高同型半胱氨酸血症的预防或治疗具有重要指导意义。
[0006]临床或实验室的诊断方法有高效液相色谱法、光谱法、微生物法、化学发光法、放射酶免疫法以及酶比色法等。上述的传统检测方法操作过程繁琐复杂，且灵敏度和特异性不足，尤其是对基质复杂且含量较低的内源性物质，检测效果不理想，无法满足检测需要。高效液相色谱
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串联质谱法(HPLC
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MS/MS)具有灵敏度高、特异性强、准确性好、通量高等特点，可同时对pg～μg级别的不同水平物质同时检测，检测范围广，不受结构类似物的影响，并且样品用量少、分析时间短，是目前临床上理想的首选方法。
[0007]专利技术人发现，目前能够同时检测同型半胱氨酸、叶酸、5
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甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12、半胱氨酸等7种物质的HPLC
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MS/MS方法未有报道，仅有检测其中一种或几种报道。由于血清基质复杂，与待测物理化性质相似的内源性物质非常多，会影响结果的灵敏度和准确性。

技术实现思路

[0008]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法、试剂盒及其应用。本专利技术通过优化前处理方法，从而实现对同型半胱氨酸、叶酸、5
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甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12和半胱氨酸等7种物质的准确检测，具有良好的实际应用之价值。
[0009]为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0010]本专利技术的第一个方面，提供一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法，所述代谢物包括同型半胱氨酸、叶酸、5
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甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12和半胱氨酸中，所述方法包括：基于LC
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MS/MS对经过前处理后的待测样品进行检测；
[0011]其中，所述前处理方法中包括向待测样品中加入维生素C，从而有效提高5
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甲基四氢叶酸的稳定性。所述维生素C浓度控制为10～30μg/mL，优选为20μg/mL。
[0012]所述待测样品为受试者血液样品，包括全血、血浆或血清，进一步优选为血清。
[0013]进一步的，所述检测方法中还包括以校准品制作标准曲线定量，同时采用质控品进行质控。
[0014]具体的，校准品工作液制备方法可以包括：采用含1～6％BSA(优选为5％)的生理盐水为基质进行配制，向上述基质中添加上述物质混标，并使用基质溶液进行稀释得不同浓度梯度的溶液，作为校准品工作液。
[0015]所述物质包括同型半胱氨酸、叶酸、5
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甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12和半胱氨酸。需要说明的是，维生素C作为保护剂，并不参与定量。
[0016]采用高和低两个水平的质控品进行质控；
[0017]具体的，使用同型半胱氨酸、叶酸、5
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甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12、半胱氨酸和维生素C终浓度分别为25μmol/L、10ng/mL、25ng/mL、50μmol/L、40ng/mL、5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法，所述代谢物包括同型半胱氨酸、叶酸、5
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甲基四氢叶酸、甲硫氨酸、维生素B6、维生素B12和半胱氨酸中，其特征在于，所述方法包括：基于LC
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MS/MS对经过前处理后的待测样品进行检测；其中，所述前处理方法包括向待测样品中加入维生素C。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述维生素C浓度控制为10～30μg/mL，优选为20μg/mL。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品为受试者血液样品，包括全血、血浆或血清，进一步优选为血清。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测方法中还包括以校准品制作标准曲线定量，同时采用质控品进行质控；优选的，校准品工作液制备方法包括：采用含1～6％BSA(优选为5％)的生理盐水为基质进行配制，向上述基质中添加上述代谢物混标，并使用基质溶液进行稀释得不同浓度梯度的溶液，作为校准品工作液；优选的，采用高和低两个水平的质控品进行质控。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述前处理方法还包括：将加入维生素C的待测样品与同位素内标工作液混合，离心，取上清液进行上机检测；所述同位素内标工作液制备方法为：将上述各代谢物的同位素内标原料加入提取液中溶解即得；优选的，各代谢物的同位素内标原料包括Hcy
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D4、FA
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13
C5、5MT
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13
C
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D3、Met
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D3、PLP
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D3、VB12
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13
C7和Cys
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13
C3；优选的，所述提取液为含有HCl的异丙醇与三氯乙酸的混合溶液；进一步的，所述提取液中还含有二硫苏糖醇，所述二硫苏糖醇浓度控制为10～20μg/mL，优选为15μg/mL。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LC
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MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：液相色谱条件包括：采用梯度洗脱，流动相A相...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯振，景叶松，弭兆元，
申请(专利权)人：山东英盛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：