一种脑脊液类器官的培养基及其培养方法技术

本发明专利技术涉及一种脑脊液类器官的培养基及其培养方法，所述培养基包括基础培养基和分化培养基，所述基础培养基含有：DMEM/F12培养液，1×Glutamax，HEPES缓冲液，抗生素antibiotics，生长因子等；所述分化培养基为含有DMEM/F12，Neurobasal，B27supplement，2‑mercaptoethanol，insulin，Glutamax和MEM‑NEAA。本发明专利技术的培养方法是基于物理重力力学膜过滤法对待收集样本进行捕获，最大程度的保证了截留细胞的无损，且未进行任何标记，实现截留细胞的抗原表位的完整性和细胞的活性；该方法基于基质胶支架进行3D培养，能够更好的维持脑脊液三维的生长环境。

【技术实现步骤摘要】
一种脑脊液类器官的培养基及其培养方法
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种脑脊液类器官的培养基及其培养方法。
技术介绍
软脑膜转移(leptomeningealmetastasis,LM)是晚期非小细胞肺癌的并发症之一。软脑膜转移的诊断和检测具有挑战性，LM反应的三个基本要素：标准化的神经学检查、脑脊液细胞学或流失细胞术以及放射学评估检查。一项神经肿瘤学反应评估工作组共识建议：所有等级参加临床试验的患者接受脑脊液分析(所有癌症的细胞学检查，血液病的流式细胞术分析)、完全增强的神经轴MRI，以及在计划的脑脊液内治疗的情况下，进行放射性同位素脑脊液血流研究。但是，目前还没有治疗软脑膜转移(LM)的标准指南。但在软脑膜转移治疗的几个关键方面已经取得了实质性的进展，包括改善了基因图谱的特征，建立了临床相关的动物模型，改进了细胞学和基因分型分析的脑脊液液体活检，以及开发了更具中枢神经系统渗透性的治疗药物。但是从脑瘤患者身上获取组织标本的挑战限制了诊断和分子特征，并阻碍了更好的治疗方法的发展。液体活检收集和分析体液中的肿瘤成分，在原发性和继发性脑肿瘤的治疗中，液体活检将作为肿瘤组织替代物的研究越来越受到人们的关注。中枢神经系统CNS恶性肿瘤研究相关的主要体液包括血液和脑脊液。虽然血液采集可能更直接，但脑脊液提供了许多优势。此外，CNS肿瘤来源的CTCs(脊液循环肿瘤细胞)在外周血中的数量较脑脊液中的数量低得多。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种培养基及其培养方法，是基于基质胶支架进行3D培养，能够更好的维持脑脊液三维的生长环境。本专利技术的目的是提供一种脑脊液类器官的培养基。本专利技术的另一目的是提供脑脊循环肿瘤细胞的培养方法。根据本专利技术的具体实施方式脑脊液类器官的培养基，所述培养基包括基础培养基和分化培养基，所述基础培养基含有：DMEM/F12培养液，1×Glutamax，HEPES缓冲液，抗生素antibiotics，生长因子B27supplement，生长因子EGF，生长因子FGF-10，生长因子IGF1，抗生素primocin，抑制剂SB431542，MEM-NEAA和Heparin50；所述分化培养基为含有DMEM/F12，Neurobasal，B27supplement，2-mercaptoethanol，insulin，Glutamax和MEM-NEAA。根据本专利技术的具体实施方式的培养基，进一步的，所述抗生素antibiotics包括青霉素和链霉素。根据本专利技术的具体实施方式的培养基，进一步的，所述基础培养基为：DMEM/F12培养液中添加1％1×Glutamax，10mMHEPES缓冲液，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，1.5％生长因子B27supplement，1％生长因子N2supplement，50ng/ml生长因子EGF，100ng/ml生长因子FGF-10，1μg/ml生长因子IGF1，0.2％的抗生素primocin，10uM抑制剂SB431542，1％MEM-NEAA和1ug/mlHeparin50；所述分化培养基为：由50％DMEM/F12培养液和50％Neurobasal培养基组成混合培养基，在所述混合培养基中添加0.5％生长因子N2supplement，1％生长因子B27supplement，3.5ul/L2-mercaptoethanol，0.025％insulin，1％1×Glutamax，0.5％MEM-NEAA和10μMY-27632。根据本专利技术的具体实施方式的脑脊循环肿瘤细胞的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：(1)将细胞捕获滤膜置于无水乙醇溶液中进行浸洗，确保所述细胞捕获滤膜完全浸润；(2)采用1×PBS完全浸润并洗涤所述细胞捕获滤膜，保证残余乙醇彻底去除；(3)截留细胞富集：将脑脊液加入到PBS中进行稀释，采用步骤(2)洗涤过的所述细胞捕获滤膜对稀释后的所述脑脊液进行过滤，然后采用HBSS缓冲液对所述细胞捕获滤膜进行多次洗涤，至膜上无可见残留物；(4)无菌镊子夹取步骤(3)的所述细胞捕获滤膜，置于所述的基础培养基中进行培养，形成脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；将所述脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液进行离心，弃上清液，得到重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；(5)将所述的分化培养基重悬备用；将温和细胞解离试剂和含有15mMHEPES的DMEM/F-12置于冰上备用；冰上解冻Matrigel备用；将低黏附培养皿置进行预热；先向每个预热后的低黏附培养皿中加入重悬后的所述分化培养基；再将解冻后的Matrigel和步骤(4)得到的所述重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液加入到所述低黏附培养皿中，混合均匀，于培养箱中进行培养。进一步的，所述培养方法包括以下步骤：(1)将细胞捕获滤膜置于无水乙醇溶液中进行浸洗，确保所述细胞捕获滤膜完全浸润；(2)采用1×PBS完全浸润并洗涤所述细胞捕获滤膜，保证残余乙醇彻底去除；(3)截留细胞富集：将脑脊液加入到PBS中进行稀释，采用步骤(2)洗涤过的所述细胞捕获滤膜对稀释后的所述脑脊液进行过滤，然后采用HBSS缓冲液对所述细胞捕获滤膜进行多次洗涤，至膜上无可见残留物；(4)无菌镊子夹取步骤(3)的所述细胞捕获滤膜，置于所述的基础培养基中进行培养，形成脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；将200ul所述脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液进行离心，弃上清液，得到重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；(5)将所述的分化培养基重悬备用；将10mL温和细胞解离试剂和10mL含有15mMHEPES的DMEM/F-12置于冰上备用；冰上解冻Matrigel备用；将低黏附培养皿置进行预热；先向每个预热后的低黏附培养皿中加入10mL重悬后的所述分化培养基；再将200ul解冻后的Matrigel和步骤(4)得到的所述重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液加入到所述低黏附培养皿中，轻轻8字混匀，于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。本专利技术的温和细胞解离试剂是兼具蛋白水解酶和胶原酶活性的温和细胞解离试剂，即DMEM高糖，含Collagenase(300U/ml)/Hyaluronidase(100U/ml)。根据本专利技术的具体实施方式的脑脊循环肿瘤细胞的培养方法，进一步的，步骤(1)中，将细胞捕获滤膜置于1-2mL75％的乙醇溶液中进行浸洗，重复3次以上，确保所述细胞捕获滤膜完全浸润。优选的，所述细胞捕获滤膜的孔径为8μm。根据本专利技术的具体实施方式的脑脊循环肿瘤细胞的培养方法，进一步的，步骤(2)中，采用1×PBS完全浸润并洗涤所述细胞捕获滤膜5次以上，保证残余乙醇彻底去除。根据本专利技术的具体实施方式的脑脊循环肿瘤细胞的培养方法，进一步的，步骤(3)中，将脑脊液沿模具内壁缓慢加入到PBS中以质量比为1：1的比例进行稀释本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脑脊液类器官的培养基，其特征在于，所述培养基包括基础培养基和分化培养基，所述基础培养基含有：DMEM/F12培养液，1×Glutamax，HEPES缓冲液，抗生素antibiotics，生长因子B27 supplement，生长因子N2supplement，生长因子EGF，生长因子FGF-10，生长因子IGF1，抗生素primocin，抑制剂SB431542，MEM-NEAA和Heparin50；/n所述分化培养基为含有DMEM/F12，Neurobasal，B27 supplement，2-mercaptoethanol，insulin，Glutamax和MEM-NEAA。/n

【技术特征摘要】
1.一种脑脊液类器官的培养基，其特征在于，所述培养基包括基础培养基和分化培养基，所述基础培养基含有：DMEM/F12培养液，1×Glutamax，HEPES缓冲液，抗生素antibiotics，生长因子B27supplement，生长因子N2supplement，生长因子EGF，生长因子FGF-10，生长因子IGF1，抗生素primocin，抑制剂SB431542，MEM-NEAA和Heparin50；
所述分化培养基为含有DMEM/F12，Neurobasal，B27supplement，2-mercaptoethanol，insulin，Glutamax和MEM-NEAA。


2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述抗生素antibiotics包括青霉素和链霉素。


3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基为：DMEM/F12培养液中添加1％1×Glutamax，10mMHEPES缓冲液，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，1.5％生长因子B27supplement，1％生长因子N2supplement，50ng/ml生长因子EGF，100ng/ml生长因子FGF-10，1μg/ml生长因子IGF1，0.2％的抗生素primocin，10uM抑制剂SB431542，1％MEM-NEAA和1ug/mlHeparin50；
所述分化培养基为：由50％DMEM/F12培养液和50％Neurobasal培养基组成混合培养基，在所述混合培养基中添加0.5％生长因子N2supplement，1％生长因子B27supplement，3.5ul/L2-mercaptoethanol，0.025％insulin，1％1×Glutamax，0.5％MEM-NEAA和10μMY-27632。


4.一种脑脊循环肿瘤细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：
(1)将细胞捕获滤膜置于无水乙醇溶液中进行浸洗，确保所述细胞捕获滤膜完全浸润；
(2)采用1×PBS完全浸润并洗涤所述细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓娇，张亮仁，刘振明，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11