从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法技术

本发明专利技术涉及细胞分离纯化技术领域，公开了一种从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，步骤：小鼠结肠加细胞解离液孵育；加细胞消化液孵育，过滤，将结肠加HBSS中离心，去除上清液加HBSS重悬，并加壳聚糖包覆改性羰基铁，用金属过滤网过滤，在过滤时对过滤网通2～5mA的微弱电流，得过滤液；用44％第一Percoll液重悬后移至底部铺有67％第二Percoll液的离心管离心；收集中间层细胞，再离心，收集沉淀；用稀释后抗体混悬细胞团，离心，收集沉淀；用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到固有淋巴样细胞。本发明专利技术能够克服大龄小鼠结肠固有层中结缔组织对固有淋巴样细胞的分离纯化的影响，提高大龄小鼠肠粘膜中固有淋巴样细胞的分离纯度和绝对细胞数量。

【技术实现步骤摘要】
从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法
本专利技术涉及细胞分离纯化
，尤其涉及一种从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法。
技术介绍
固有淋巴样细胞(Innatelymphoidcells，简称ILC)是一类近些年来见诸于报道的特殊淋巴细胞，缺乏重排的抗原特异性受体。ILC家族主要分为ILC1、ILC2、ILC3、ILCreg，还包括NK细胞和淋巴组织诱导细胞(LTi)。目前发现，ILC可以从组织微环境中接收其它细胞的信号，在粘膜表面发挥着重要的免疫作用。他们可以调节组织内动态平衡、粘膜和非粘膜组织的炎症与修复；其主要存在于小肠、结肠、肺、皮肤、脂肪组织、淋巴组织等部位。ILC主要通过分泌细胞因子、通过与间质细胞以及其它免疫细胞之间的相互作用发挥效应作用。随着免疫活性细胞分离方法的进步，肠道黏膜免疫得到越来越多的免疫科学工作者的重视，肠道黏膜免疫的研究已成为免疫学研究热点之一。肠道黏膜免疫系统是潜在病原体、食品以及共生菌的共同入口。肠道黏膜免疫系统长期暴露于复杂的环境中，因此能够对食品和共生菌的刺激产生耐受，同时对病原体的刺激产生免疫反应。肠黏膜主要由上皮层、固有层及浆膜层构成，含有种类丰富、数目繁多的免疫细胞，是哺乳动物识别、捕获经消化道进入体内的外界病原微生物的重要场所，其功能与感染、肿瘤等多种疾病密切相关。近年针对ILC的研究逐渐兴起，有助于提升抗感染、抗肿瘤等临床诊疗水平。对肠黏膜中原代ILC进行分离纯化是开展此类研究的关键前提条件。申请号的CN201810208300.7的专利申请文件公开了一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，具体过程包括：获取动物结肠，经清洗、剪碎后置于离心管中，加入上皮剥离液搅拌剥离；移除上清液，加入中和液1，搅拌；移除上清液，加入中和液2，静置分离；移除上清液，加入消化酶混合液，搅拌消化；加入HBSS离心，移除上清后，用HBSS重悬后过滤；所得滤液离心后用Percoll液重悬后移至底部铺有Percoll液的离心管；离心，中间层细胞收集，离心，收集沉淀；用稀释后抗体混悬所得的细胞团，离心，收集沉淀；用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到ILC。上述技术方法虽然能够从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴样细胞，但是其只适用于从小龄小鼠(周龄16周以下)的小肠粘膜中分离纯化固有淋巴样细胞，而对于大龄小鼠(周龄16周以上)，由于大龄小鼠肠粘膜中，尤其是结肠固有层中的结缔组织较多，在分离纯化固有淋巴样细胞时，结肠固有层中的结缔组织不易分离去除，导致固有淋巴样细胞分离后的纯度较低，固有淋巴样细胞绝对数量较少，影响后期对固有淋巴样细胞的研究。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，能够克服大龄小鼠结肠固有层中的结缔组织对固有淋巴样细胞的分离纯化的影响，提高大龄小鼠结肠固有层中固有淋巴样细胞的分离纯度和绝对细胞数量，利于固有淋巴样细胞的后期研究。本专利技术通过以下技术手段解决上述技术问题：一种从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，包括以下步骤，A1、获取周龄16～40周小鼠的结肠，经清洗、剪碎后置于离心管中，加入细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后进行旋涡；A2、去除上清液，再加入细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后再次旋涡，得到第一混合液；A3、将再次涡旋混匀后的第一混合液去除上清液，将结肠转移到0～5℃的PBS溶液中，加入细胞消化液、0.3～0.5mol/L的氢氧化铁和0.1～0.2mol/L的氢氧化铝组成的混合溶液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后利用80mm滤网进行初滤，得到第二混合液；氢氧化铁和氢氧化铝溶液的加入，可以对第一混合液中的部分结缔组织进行絮凝，并且可以使得Fe3+、Al3+与部分结缔组织进行吸附，使得在进行初滤的时候能够将大部分的结缔组织过滤分离出去，便于下一步结缔组织的精过滤；A4、对第二混合液用100μm滤网进行过滤，将结肠加入HBSS中离心，然后去除上清液之后，再加入HBSS重悬，并加入壳聚糖包覆改性羰基铁，旋转摇动得到第三混合液，对第三混合液使用60～80μm金属过滤网过滤，在过滤过程中对过滤网通2～5mA的微弱电流，得到过滤液；A5、将步骤A4得到的过滤液离心，然后用44％的第一Percoll液重悬后移至底部铺有67％的第二Percoll液的离心管，800g离心10～20分钟；A6、取中间层细胞收集，再次离心，收集沉淀；A7、用稀释后抗体混悬步骤6所得的细胞团，离心，收集沉淀；A8、用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到固有淋巴样细胞。进一步，所述步骤A1和A2中细胞解离液均为D-Hanks+10mMHEPES+5mMEDTA，所述D-Hanks、HEPES、EDTA的体积比为1:1:1。进一步，所述步骤A3中细胞消化液为D-Hanks+500μg/mL胶原酶D+500μg/mLDNase1+0.5U/mL分散酶+2％FBS溶液组成的混合溶液。进一步，所述步骤A3中D-Hanks、500μg/mL胶原酶D、500μg/mLDNase1、0.5U/mL分散酶和2％FBS溶液的体积比为1:1:1:1:1。进一步，所述步骤A6和A7中再次离心采用20℃、800g离心10～20分钟。进一步，所述稀释后抗体是指含990μl流式缓冲液与10μl抗体原液，稀释比为1:100。进一步，所述步骤A7中抗体为DAPI、LIN、CD3、CD45、CD90.2或其任意的组合；所述LIN为CD11c、CD19、CD45R/B220、Ly6G/Ly6C、CD11b、FcεRIα、NK1.1或其任意的组合。进一步，所述步骤A8中流式缓冲液为PBS+FBS的混合溶液，其中FBS终浓度5％；所述流式细胞术策略为DAPI-LIN-CD3-CD45+CD90.2+。进一步，所述壳聚糖包覆改性羰基铁的制备方法，包括以下步骤，B1、按质量份数，取5～8份的纳米羰基铁粉末放入容器中，加入20～30份的无水乙醇，使用超声分散10～15分钟，加入10～15份的氨水，然后加热到35～40℃，在搅拌状态下逐滴加加入3～5份的正硅酸乙酯，搅拌均匀后反应4～5小时，在氮气保护下进行抽滤、洗涤并烘干，得到改性羰基铁；B2、取8～10份的壳聚糖颗粒溶于100～200份的去离子水中，搅拌均匀得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液以20～30kHz的功率超声后，加入40～50份的乙酸，在40℃恒温下搅拌1h，静置；B3、向步骤B2处理后的壳聚糖溶液中加入30～40份的正己烷，在搅拌状态下滴入Span80进行预乳化，然后加入步骤B1中得到的改性羰基铁和1～2份的三乙烯四胺，40℃恒温下静置1～2h；B4、静置后，以6000～8000r/min的速率搅拌10～20min，然后逐滴加入8～10份的环氧氯丙烷，40℃恒温下静本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤，/nA1、获取周龄16～40周小鼠的结肠，经清洗、剪碎后置于离心管中，加入细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后进行涡旋混匀；/nA2、去除上清液，再加入细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后再次涡旋混匀，得到第一混合液；/nA3、将再次涡旋混匀后的第一混合液去除上清液，将结肠转移到0～5℃的PBS溶液中，加入细胞消化液、0.3～0.5mol/L的氢氧化铁和0.1～0.2mol/L的氢氧化铝组成的混合溶液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后利用80mm滤网进行初滤，得到第二混合液；/nA4、对第二混合液用100μm滤网进行过滤，将结肠加入HBSS中离心，然后去除上清液之后，再加入HBSS重悬，并加入壳聚糖包覆改性羰基铁，旋转摇动得到第三混合液，对第三混合液使用60～80μm金属过滤网过滤，在过滤过程中对过滤网通2～5mA的微弱电流，得到过滤液；/nA5、将步骤A4得到的过滤液离心，然后用44％的第一Percoll液重悬后移至底部铺有67％的第二Percoll液的离心管，800×g离心10～20分钟；/nA6、取中间层细胞收集，再次离心，收集沉淀；/nA7、用稀释后抗体混悬步骤6所得的细胞团，离心，收集沉淀；/nA8、用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到固有淋巴样细胞。/n...

【技术特征摘要】
1.从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤，
A1、获取周龄16～40周小鼠的结肠，经清洗、剪碎后置于离心管中，加入细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后进行涡旋混匀；
A2、去除上清液，再加入细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后再次涡旋混匀，得到第一混合液；
A3、将再次涡旋混匀后的第一混合液去除上清液，将结肠转移到0～5℃的PBS溶液中，加入细胞消化液、0.3～0.5mol/L的氢氧化铁和0.1～0.2mol/L的氢氧化铝组成的混合溶液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后利用80mm滤网进行初滤，得到第二混合液；
A4、对第二混合液用100μm滤网进行过滤，将结肠加入HBSS中离心，然后去除上清液之后，再加入HBSS重悬，并加入壳聚糖包覆改性羰基铁，旋转摇动得到第三混合液，对第三混合液使用60～80μm金属过滤网过滤，在过滤过程中对过滤网通2～5mA的微弱电流，得到过滤液；
A5、将步骤A4得到的过滤液离心，然后用44％的第一Percoll液重悬后移至底部铺有67％的第二Percoll液的离心管，800×g离心10～20分钟；
A6、取中间层细胞收集，再次离心，收集沉淀；
A7、用稀释后抗体混悬步骤6所得的细胞团，离心，收集沉淀；
A8、用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到固有淋巴样细胞。


2.根据权利要求1所述的从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：所述步骤A1和A2中细胞解离液均为D-Hanks+10mMHEPES+5mMEDTA，所述D-Hanks、HEPES、EDTA的体积比为1:1:1。


3.根据权利要求2所述的从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：所述步骤A3中细胞消化液为D-Hanks+500μg/mL胶原酶D+500μg/mLDNase1+0.5U/mL分散酶+2％FBS溶液组成的混合溶液。


4.根据权利要求3所述的从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：所述步骤A3中D-Hanks、500μg/mL胶原酶D、500μg/mLDNase1、0.5U/mL分散酶和2％FBS溶液的体积比为1:1:1:1:1。
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【专利技术属性】
技术研发人员：易龙，糜漫天，候鹏飞，余利，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50