基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法、细胞及产品技术

本发明专利技术基于外周血的LCL‑NK细胞联合培养方法，包括：由外周血制备获取PBMC；由PBMC制备获得LCL细胞；LCL细胞为将PBMC在含有EBV上清液中培养获得；EBV上清液为B958细胞经培养传代后，再经饥饿裂解后分离获得；由PBMC、LCL细胞、细胞因子以及培养液形成的培养体系下共同培养。本方案的培养方法有效地提高了细胞产品的纯度，并且在培养效率和NK细胞杀伤性等多方面有显著的提升。

【技术实现步骤摘要】
基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法、细胞及产品
本专利技术属于生物及生物医疗
，具体涉及一种基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法、细胞及产品。
技术介绍
免疫反应能从病原体中保护人体，且免疫系统由众多免疫相关细胞和细胞因子组成。白细胞，尤其淋巴细胞在免疫系统中起重要作用。组成淋巴细胞的代表性细胞包括先天免疫系统细胞和后天免疫系统细胞。自然杀伤细胞(NK细胞)是一种具代表性的先天免疫细胞，已知自然杀伤细胞能以非特异性方式杀伤肿瘤，识别并杀伤病毒、细菌等，而且可以用酶如穿孔素和颗粒酶杀伤病原体，或通过Fas-FasL相互作用杀伤病原体。据报告称，对于肿瘤患者而言，NK细胞的杀伤肿瘤细胞的能力的降低与肺肿瘤(CarregaP,etal.,Cancer,2008:112:863-875)、肝肿瘤(JinushiM,etal.,JHepatol.,2005:43；1013-1020)、乳肿瘤(BauernhoferT,etal.,EurJImmunol.,2003:33:119-124)、子宫肿瘤(MocchegianiE.,etal.,BrjCancer.,1999:79:244-250)、血肿瘤(TajimaF.,etal,Lekemia1996:10:478-482)等疾病的发病紧密相连。因此，为了肿瘤治疗，必须要提高肿瘤患者的自然杀伤细胞的有关杀伤肿瘤细胞的能力及活性。目前，尝试着利用如NK细胞的杀伤肿瘤细胞的能力来治疗实体肿瘤(solidcancer)或血液肿瘤。NK细胞是一种先天性免疫的重要细胞，大约占人外周血淋巴细胞的10％-15％。NK细胞特异性表达CD56和CD16，而不表达CD3。并且根据这些表达分子表面强度的差异又将NK细胞分为2种亚型，即CD56dimCDl6bright和CD56brightCDl6dim,其中CD56dimCDl6bright亚型主要分布于外周血，表达免疫球蛋白样受体(killercellinhibitoryreceptor，KIR),具有高杀伤活性；而CD56brightCDl6dim亚型主要分布于周围淋巴器官，以分泌细胞因子为主，起到免疫调节作用。最重要的是，NK细胞作为人体免疫系统的第一道防，和T、B淋巴细胞不同，它不需要相关抗原预刺激，就能识别和杀伤肿瘤细胞以及病毒感染细胞等靶细胞。NK细胞的活性主要是通过细胞表面活化性和抑制性受体与靶细胞表面的相应特异性配体相互作用所介导的抑制性和活化性信号之间的平衡来实现的。当两者之间的活化性信号超越了抑制性信号，NK细胞将被激活，介导对肿瘤细胞的杀伤功能。NK细胞的杀伤功能主要通过直接杀伤作用、分泌细胞因子等机制发挥。其中，直接杀伤作用包括穿孔素或颗粒酶途径以及细胞凋亡。除此之外，NK细胞还能通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcell-mediatedcytoxicity，ADCC)发挥其独特的抗病毒和抗肿瘤作用。为了获得杀伤肿瘤细胞的效果，而需要大量的NK细胞，但难以保证从肿瘤症患者中能够获得大量血液，且血液中的NK细胞的量所占的比例也仅仅约5～20％。由于难以使用NK细胞作为免疫治疗剂，从而重点在于能够有效地扩增NK细胞。常用于扩增NK细胞的现有方法包括，利用如磁激活细胞分选(magneticactivatedcellsorter，MACS)、cliniMACS或荧光激活细胞分选(fluorescenceactivatedcellsorter，FACS)等装置从骨髓或血液的单个核细胞中分离或诱导出NK细胞。在这种方法中，进行如下操作：1)在早期，从单个核细胞中分离NK细胞，并利用细胞因子对NK细胞进行扩增培养；2)去除与单个核细胞共存的T细胞，并利用细胞因子对NK细胞进行扩增培养；及3)在骨髓中存在的干细胞中诱导NK细胞。此外，根据已有的报告，通过利用饲养细胞从外周血单个核细胞(PBMCs)中分离NK细胞的方法包括，意大利Torelli研究小组的利用源自B细胞白血病的RPMI8866细胞株的方法和日本Ishikawa研究小组的利用源自肾母瘤细胞(Wilmstumorcell)的HFWT细胞株的方法。大量体外研究表明NK细胞有着良好的抗肿瘤活性，因此，基于NK细胞的免疫治疗在近几年被逐渐应用于临床治疗，而其中的研究热点主要是NK细胞的输注治疗。在恶性血液病中，NK细胞输注主要用于治疗白血病、淋巴瘤等临床研究中，但是NK细胞过继免疫治疗的临床效果多不理想，可能的重要原因就是NK细胞的数量和杀伤活性不足。因此，如何提高NK细胞在体外的扩增效率以及使扩增后的NK细胞同时具有高杀伤活性是基础和临床工作者需要解决的关键问题。
技术实现思路
本专利技术的基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法、细胞及产品，通过采用联合培养的方法有效地提高了细胞产品的纯度，并且在培养效率和NK细胞杀伤性等多方面有显著的提升。本专利技术的基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法，包括：由外周血制备获取PBMC；由PBMC制备获得LCL细胞；LCL细胞为将PBMC在EBV上清液中培养获得；EBV上清液为B958细胞经培养传代后，再经饥饿裂解后分离获得；由PBMC、LCL细胞、细胞因子以及培养液形成的培养体系下共同培养。本专利技术的基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法的一种改进，细胞因子包括IL-2、IL-15、IL-21、Flt3-L、SCF、IL-7、IL-12和IL18中的一种或多种。优选的，细胞因子的浓度为80-200U/mL。本专利技术的基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法的一种改进，在培养体系中的LCL细胞还预先经过辐射灭活处理，辐射灭活处理为通过放射线和/或者紫外线进行照射灭活。进一步优选的，辐射灭活处理的辐射剂量为40-50Gy。紫外线照射，照射强度的0.050-0.200J/cm2。本专利技术的基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法的一种改进，共同培养在37℃、5％CO2条件下进行。本专利技术的基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法的一种改进，共同培养体系中的培养液为10％FBS/RPMll640培养液。10％FBS/RPM11640，就是加入10％胎牛血清的RPMll640培养液。本专利技术的基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法的一种改进，PBMC为人外周血与等体积量的PBS缓冲液混合均匀后，滴加到淋巴细胞分离液液面形成分层的液相形态，水平离心800g，20min后，形成3层液相，吸取3层液相中白色云雾层至适量的PBS缓冲液并离心分离除杂即可。本专利技术的基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法的一种改进，离心分离除杂包括至少进行2次离心分离操作，每次离心分离操作为将待分离物加入到至少5倍体积倍量的PBS缓冲液中，离心300g，5min，弃上清；所示待分离物为白色云雾层或上一次离心分离去上清后的剩余物。本专利技术的基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法的一种改进，EBV上清液制备时B958细胞的培养传代为将B958细胞放入含有1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法，包括：/n由外周血制备获取PBMC；/n由PBMC制备获得LCL细胞；所述LCL细胞为将PBMC在EBV上清液中培养获得；所述EBV上清液为B958细胞经培养传代后，再经饥饿裂解后分离获得；/n由PBMC、LCL细胞、细胞因子以及培养液形成的培养体系下共同培养。/n

【技术特征摘要】
1.基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法，包括：
由外周血制备获取PBMC；
由PBMC制备获得LCL细胞；所述LCL细胞为将PBMC在EBV上清液中培养获得；所述EBV上清液为B958细胞经培养传代后，再经饥饿裂解后分离获得；
由PBMC、LCL细胞、细胞因子以及培养液形成的培养体系下共同培养。


2.根据权利要求1所述基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法，其特征在于，所述细胞因子包括IL-2、IL-15、IL-21、Flt3-L、SCF、IL-7、IL-12和IL18中的一种或多种。


3.根据权利要求1所述基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法，其特征在于，在所述培养体系中的LCL细胞还预先经过辐射灭活处理，所述辐射灭活处理为通过放射线和/或者紫外线进行照射灭活。


4.根据权利要求1所述基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法，其特征在于，所述共同培养在37℃、5％CO2条件下进行。


5.根据权利要求1所述基于外周血的LCL-NK细胞联合培养方法，其特征在于，所述共同培养体系中的培养液为10％FBS/RPMll64...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈健，欧阳效晴，葛永，杨淑青，
申请(专利权)人：江苏蒙彼利生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32