一种具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，属于生物医药技术领域。本发明专利技术通过控制红细胞表面DSPE‑PEG‑X分子的修饰量，实现了红细胞形貌的可控调节，从而可控制备得到具有足够形变能力的红细胞，以这种红细胞为基础进一步即可制备得到具有理想形貌的红细胞团簇。本发明专利技术实现了具有理想形貌的红细胞团簇的可控制备，所制备得到的红细胞团簇可对目标稀有细胞进行高效高特异性地富集。

【技术实现步骤摘要】
一种具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法
本专利技术属于生物医药
，涉及红细胞团簇制备方法的优化，具体涉及一种具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法。
技术介绍
已公开的两篇专利CN111826349A、CN111826351A均使用了红细胞团簇材料用于外周血中的循环肿瘤细胞(CTCs)的特异性捕获及富集。基于叶酸(或抗体)修饰的红细胞膜蛋白与表面修饰微球之间存在分子间作用力的原理，红细胞可吸附在表面修饰微球上；而由于红细胞表面所带的负电荷导致其互相之间存在静电斥力，这可能造成红细胞难以在微球表面形成满满表层吸附状态，通过预先红细胞表面静电吸附阳离子型聚合物聚凝胺分子，即可大大减弱红细胞之间的静电斥力，从而实现微球表面红细胞满层吸附。微球表面紧密吸附叶酸(或抗体)修饰的红细胞后所形成的红细胞团簇在靶向CTCs的同时，可以很好地避免与白细胞发生非特异性吸附，从而使得最终捕获得到高纯度的CTCs。事实上，即使叶酸(或抗体)修饰的红细胞预先用聚凝胺吸附以降低红细胞之间的排斥力，也存在一定可能无法得到表面红细胞覆盖较紧密的红细胞团簇，也就是说现有的红细胞团簇制备技术无法稳定可控制备获得理想的红细胞团簇，制备技术亟待进一步优化和改进。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有红细胞团簇制备技术中存在的问题，提供一种具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法。红细胞团簇的理想形貌指的是核心微球表面被尽量多的红细胞所吸附覆盖，形成的红细胞团簇所暴露的核心微球表面十分分散，吸附态红细胞之间距离足够近，均不利于白细胞在核心微球表面的非特异性吸附；而游离态CTCs则可以通过与红细胞表面通过抗原抗体特异性结合来实现被捕获。本专利技术首先对红细胞团簇形成的原理进行了分析。根据前人的研究成果，核心微球表面的羧基或者氨基可与蛋白分子形成氢键作用力，从而对蛋白发生吸附。而红细胞膜表面分布有膜蛋白分子，因此核心微球通过吸附红细胞膜表面的膜蛋白实现了对红细胞的吸附。对于不太新鲜的红细胞样本来说，膜表面蛋白含量可能发生衰减，从而不利于核心微球对衰老红细胞的吸附，因此分析不新鲜的血液样本提取出的红细胞无法制备得到完善的红细胞团簇。鉴于此，每次都使用新鲜血液提取的红细胞来制备红细胞团簇，很多情况下确实能够获得较理想的红细胞团簇，但仍然存在失败的情况，由此说明了红细胞新鲜度并不是最关键的影响因素。多次实验后发现，按照现有的红细胞团簇制备方法，即使不新鲜的红细胞也存在可能制备得到相对理想的红细胞团簇。不考虑红细胞新鲜度的情况下，每次加入了DSPE-PEG-FA修饰后得到的红细胞形貌存在少量的不同，部分实验得到的是光滑圆润的球形红细胞，而部分实验则得到的是表面带有尖刺的球形红细胞，同时由前者制备得到的红细胞团簇大多不够理想，而后者则大多都为理想的红细胞团簇，由此说明了红细胞修饰了DSPE-PEG-FA后的形貌对最终制备得到的红细胞团簇的理想程度存在相关性。红细胞表面叶酸的修饰是通过DSPE-PEG-X类型分子的DSPE段在细胞膜中的疏水作用力来实现的，原理如图1所示。而修饰到的DSPE-PEG-FA中的PEG链段互相之间存在一定的空间位阻，那么当DSPE-PEG-FA修饰量较大时，PEG链段之间的空间排斥即导致了红细胞外形的改变，由原本的圆盘状转变成球形。由此联想到，如果DSPE-PEG-FA的修饰量较小，那么对红细胞形貌的改变程度应该较小，因此本专利技术首先探究了红细胞表面DSPE-PEG-X的修饰量对其形貌的影响。研究中发现，当红细胞膜表面DSPE-PEG-X修饰量不大时，DSPE-PEG-X分子之间互相产生的空间位阻较小，仅对红细胞的表面产生凸起形变；而当红细胞表面DSPE-PEG-X的修饰量较大时，PEG链段之间存在较大的空间位阻，会导致红细胞形状转化带尖刺的球形；当DSPE-PEG-X的修饰量进一步增大，尖刺变得更小，红细胞整体形状变得更圆润，如图2所示。进一步的实验发现，DSPE-PEG-X修饰量较小的红细胞的形变能力较好，而修饰量较大的圆球形的棘形红细胞则形变能力较差，如图3所示。在红细胞团簇制备过程中，需要通过吹悬的方式将红细胞团簇与多余的红细胞分开，从而将多余的红细胞分离出去，获得纯粹的红细胞团簇。对于形变能力较好的红细胞来说，其与表面修饰微球贴近时，红细胞通过发生形变的方式与微球形成较大面积的接触，由此产生的吸附力较大，吹悬操作的冲击力很难导致红细胞从微球表面脱离，因而最终可获得的表面紧密吸附红细胞层的红细胞团簇。然而，对于形变能力较差的红细胞来说，其刚性也相对较大，那么其与表面修饰微球贴近时，难以通过红细胞的形变而发生较大面积的接触，因而二者之间的吸附作用力相对较弱，吹悬操作所产生的冲击力容易引发吸附的红细胞从红细胞团簇表面剥落的后果，进而导致最终难以获得表面紧密吸附红细胞层的红细胞团簇。从现有实验结果来看，过多的DSPE-PEG-X修饰会导致红细胞刚性太强，进而导致微球表面吸附量发生减少。图4表示了五种形貌的红细胞与相同量微球制备团簇的结果，从图中可以看出，随着红细胞形貌的变化，制备得到红细胞团簇的红色发生了规律性变化，红色深浅代表着红细胞吸附量的区别，颜色越深的样本红细胞吸附量越大。从左至右，样本1的DSPE-PEG-X的修饰量最大，所对应的红细胞越接近球形，刚性也就越大，其所制备的红细胞团簇上红细胞吸附量最少，因而红细胞团簇表观颜色最浅。随着DSPE-PEG-X的修饰量逐渐降低，样本2和3的红细胞团簇表观颜色逐渐加深，说明随着DSPE-PEG-X的修饰量降低，红细胞形变能力也越强，使得红细胞团簇的红细胞吸附量逐渐增加。随着DSPE-PEG-X的修饰量进一步降低，样本3和4的表观颜色差别不大，说明即使DSPE-PEG-X的修饰量进一步降低，而红细胞形变能力也变化不大，最终红细胞团簇所吸附的红细胞量也变化不大。样本5是用无DSPE-PEG-X分子修饰的原始红细胞制备的红细胞团簇，这种红细胞表面仅仅修饰了聚凝胺，不修饰DSPE-PEG-X分子的原始红细胞形变能力最强，因而同样能够获得理想的红细胞团簇，其表观颜色与样本3和样本4都差别不大。从以上探索实验的结果可总结出，制备理想团簇的关键在于利用合适的表面修饰方法使红细胞保持足够的形变能力。具体对于表面修饰DSPE-PEG-X分子的红细胞来说，需要能够控制该分子在红细胞表面修饰量在合理的范围内，才能最终获得理想的红细胞团簇。基于上述内容，本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，为通过控制红细胞表面DSPE-PEG-X分子的修饰量，实现红细胞形貌的可控调节，从而可控制备得到具有足够形变能力的红细胞，以这种红细胞为基础可制备得到具有理想形貌的红细胞团簇。红细胞团簇的制备方法可参考中国专利CN111826349A(一种基于尺寸过滤法富集循环肿瘤细胞的红细胞团簇)、CN111826351A(一种基于磁性分离法富集循环肿瘤细胞的磁性红细胞团簇)。所述的制备方法中，红细胞与DSPE-PEG-X的用量关系优选为5×107个红细胞:0.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，其特征在于：所述的制备方法为通过控制红细胞表面DSPE-PEG-X分子的修饰量，实现红细胞形貌的可控调节，从而可控制备得到具有足够形变能力的红细胞，以这种红细胞为基础可制备得到具有理想形貌的红细胞团簇；其中，X代表叶酸、RGD或biotin；红细胞与DSPE-PEG-X的用量关系为5×10

【技术特征摘要】
1.一种具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，其特征在于：所述的制备方法为通过控制红细胞表面DSPE-PEG-X分子的修饰量，实现红细胞形貌的可控调节，从而可控制备得到具有足够形变能力的红细胞，以这种红细胞为基础可制备得到具有理想形貌的红细胞团簇；其中，X代表叶酸、RGD或biotin；红细胞与DSPE-PEG-X的用量关系为5×107个红细胞:0.04mg以下的DSPE-PEG-X。


2.一种具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)按照下述方法A或B在红细胞表面修饰上叶酸或RGD或肿瘤细胞靶向的抗体
A、红细胞表面修饰上叶酸或RGD：往红细胞分散液中加入DSPE-PEG-FA或DSPE-PEG-RGD，孵育后，离心、洗涤获得表面修饰叶酸或RGD的红细胞；其中，红细胞与DSPE-PEG-FA或DSPE-PEG-RGD的用量比例关系为每5×107个红细胞加入0.04mg以下的DSPE-PEG-FA或DSPE-PEG-RGD；
B、红细胞表面修饰上抗体：往红细胞分散液中加入DSPE-PEG-biotin，孵育后，离心、洗涤获得biotin修饰的红细胞；将biotin修饰的红细胞加到SA溶液中混匀，孵育后，离心洗涤获得SA修饰的红细胞；将SA修饰的红细胞加到生物素化抗体溶液中混匀，孵育后，离心洗涤获得修饰抗体的红细胞；其中，红细胞、DSPE-PEG-biotin、SA、生物素化抗体的用量比例关系为5×107个红细胞:0.04mg以下的DSPE-PEG-biotin:10～100μg的SA:0.5～5μg的生物素化抗体；
(2)红细胞表面聚凝胺的修饰
将步骤(1)表面修饰上叶酸、RGD或抗体的红细胞加到聚凝胺溶液中混匀，孵育后，离心洗涤获得表面修饰聚凝胺与叶酸、RGD或抗体的红细胞，将分散备用；其中，表面修饰上叶酸、RGD或抗体的红细胞中的红细胞与聚凝胺的用量比例关系5×107个红细胞:1～5mg的聚凝胺；
(3)红细胞团簇的制备
将表面修饰羧基或氨基的磁性微球与步骤(2)得到的红细胞混合均匀后，离心后进行孵育，再将混合物重悬用磁力架对其进行磁性分离洗涤，得到具有理想形貌的红细胞团簇。


3.根据权利要求2所述的具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，其特征在于：步骤(1)的方法A中，所述的DSPE-PEG-FA或DSPE-PEG-RGD的分子量为2000～10000，所述的孵育为4～37℃下静置孵育0.5～30min。


4.根据权利要求2所述的具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法，其特征在于：步骤(1)的方法A为：根据红细胞分散液的红细胞含量，每定量取出5×107个红细胞，定量加入含有0～0.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘威，彭伟，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42