一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法技术

本发明专利技术属于原代细胞分离培养技术领域，尤其是一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法，解决了现有技术中FRCs细胞分离成本非常高，分离技术十分复杂，分离技术门槛高，而且培养周期长，稳定性差等问题，所述低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法，包括以下步骤：采用胶原酶P一步消化小鼠脾脏碎块，消化、分离得到混合细胞；对混合细胞进行体外培养，使用含有EDTA的胰蛋白酶消化；分多次逐步纯化小鼠脾脏网状成纤维细胞，纯化至分析鉴定终纯度可以达到98％以上即得。本发明专利技术操作简单方便，成本低，对设备要求低，不需要磁珠分选和流式细胞仪分选平台。

【技术实现步骤摘要】
一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法
本专利技术涉及原代细胞分离培养
，尤其涉及一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法。
技术介绍
网状成纤维细胞(Fibroblasticreticularcells,FRCs)是有重要免疫调节作用的细胞，其在免疫应答、免疫耐受等过程中起到了非常重要的作用；脾脏的FRCs同样是埃博拉病毒、拉沙热病毒和马尔堡病毒感染的靶细胞，其还是出血热病毒体内感染的主要靶细胞，且原代FRCs细胞更能反应体内感染的机制和病理过程。小鼠原代FRCs细胞在脾脏含量极低，不高于千分之三。现有技术中，分离小鼠脾脏FRCs细胞，多采用Dispase、CollagenaseP及DNaseI三种酶消化使用三个15分钟时间段的分布消化方案；再运用磁珠分选富集和流式细胞仪精确分选逐级分选得到纯化的FRCs细胞。磁珠分选和流式细胞仪实验要求门槛和成本都很高。因此，现有的小鼠原代FRCs细胞的分离普遍存在分离成本非常高，分离技术十分复杂，分离技术门槛高，而且培养周期长，稳定性差等问题。基于上述陈述，本专利技术提出了一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中FRCs细胞分离成本非常高，分离技术十分复杂，分离技术门槛高，而且培养周期长，稳定性差等问题，而提出的一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法。一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法，包括以下步骤：r>S1、采用胶原酶P一步消化小鼠脾脏碎块，消化30-50分钟，得消化产物I；S2、将消化产物I用5ml吸头吹打1分钟后静置1分钟，吸取上清消化产物(弃去较大的没有消化完全的组织碎片)，按照比例1:1，加入4℃预冷的营养液(含10％FBS、1％双抗的DMEM，下同)，设置离心温度为4℃，离心转速为300g，离心5分钟后弃去上清液，获得细胞沉淀物，将细胞沉淀物用营养液悬浮，然后接种于25cm2培养瓶I中，37℃，5％CO2贴壁12小时后(过夜)，弃去培养液，贴壁细胞使用DMEM洗两遍后，加入6ml营养液37℃，5％CO2培养，培养过程中每3-7天换一次营养液，且每次换液前用DMEM洗贴壁细胞两次；S3、待步骤S2中的培养瓶I中长满细胞后(培养2-3周后)，使用无钙、镁离子的PBS洗两遍，再加入0.05％胰蛋白酶消化30-120秒，弃去培养瓶I和没有消化下来的细胞，得消化产物II，将消化产物II转入新的25cm2培养瓶II中，37℃，5％CO2培养3-9小时后，弃去培养基和没有贴壁的细胞，往培养瓶II中加入6ml营养液，37℃，5％CO2培养；S4、待步骤S3中的培养瓶II中长满细胞后，重复步骤S3中的操作，重复4次以上，逐步纯化小鼠脾脏网状成纤维细胞，直至流式鉴定细胞纯度达到98％以上，即得所需的原代小鼠脾脏网状成纤维细胞。优选的，所述步骤S1的具体操作如下：(1)选取4周龄小鼠，颈椎脱臼致死，75％乙醇浸泡消毒10分钟，从背部取脾脏；(2)4℃无菌PBS洗涤脾脏两次后，使用灭菌眼科剪在灭菌青霉素瓶中将脾脏剪碎至1mm3的小块，再次用4℃无菌PBS洗两遍，加入0.2mg/ml胶原酶P的消化液5-10ml，37℃消化30-50分钟，期间每十分钟混匀消化液和脾脏碎片一次，消化完成得消化产物I。优选的，所述分离和培养方法中所用营养液均为含10％FBS和1％双抗的DMEM。本专利技术提出的一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法，具有以下有益效果：1、本专利技术巧妙利用成纤维细胞的贴壁特性，避免了现有分离方法中磁珠分选和流式细胞仪这两个实验平台的使用；专利技术人通过实验摸索，逐步简化实验步骤，增加了分离步骤的可操作性，并降低了对实验器材的依赖性；同时大幅减少了分离和培养过程中酶的使用种类和成本。2、本专利技术采用多种细胞共培养的原代细胞培养方式，细胞增值快，多种细胞相互营养扶持，减少了原代细胞的生长时间，弥补了后续步骤中多次纯化培养造成的时间消耗，本专利技术分离培养得到的原代小鼠脾脏网状成纤维细胞稳定性好，可以有效应用于该领域的科学研究，也是潜在的免疫治疗的靶点。3、本专利技术提供的原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法，操作简单方便，成本低，本专利技术的技术方案与现有技术方案分离周期相近，分离纯度相近(达到98％以上)，但成本却较现有技术降低90％以上，对设备要求低，不需要磁珠分选和流式细胞仪分选平台。附图说明图1为本专利技术提出的一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法中分离得到的原代FRCs流式鉴定图；图中：上左：FSVSSS细胞群图；上右：特异抗体podoplanin-PE抗体同型对照和表达图，阳性率为99.9％；下左：Percp-Cy5.5和BB515同型对照图；下右：CD45-Percp-Cy5.5和CD31-BB515均为阴性。图2为本专利技术提出的一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法中分离得到的原代FRCs激光共聚焦鉴定图；图中：从左到右：Dapi(蓝色)、anti-Fibroblast(绿色)、podoplanin(红色)、三种颜色合并，纯化分离的细胞符合FRCs表型。图3为本专利技术提出的一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法中分离得到的原代FRCs相差显微镜形态图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步解说。实施例一本专利技术提出的一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法，包括以下步骤：S1、选取4周龄小鼠，颈椎脱臼致死，75％乙醇浸泡消毒10分钟，从背部取脾脏；用4℃无菌PBS洗涤脾脏两次后，使用灭菌眼科剪在灭菌青霉素瓶中将脾脏剪碎至1mm3的小块，再次用4℃无菌PBS洗两遍，加入0.2mg/ml胶原酶P的消化液5-10ml，37℃消化30-50分钟，期间每十分钟混匀消化液和脾脏碎片一次，消化完成得消化产物I；S2、将消化产物I用5ml吸头吹打1分钟后静置1分钟，吸取上清消化产物(弃去较大的没有消化完全的组织碎片)，按照比例1:1，加入4℃预冷的营养液(含10％FBS、1％双抗的DMEM，下同)，设置离心温度为4℃，离心转速为300g，离心5分钟后弃去上清液，获得细胞沉淀物，将细胞沉淀物用营养液悬浮，然后接种于25cm2培养瓶I中，37℃，5％CO2贴壁12小时后(过夜)，弃去培养液，贴壁细胞使用DMEM洗两遍后，加入6ml营养液37℃，5％CO2培养，培养过程中每3-7天换一次营养液，且每次换液前用DMEM洗贴壁细胞两次；S3、待步骤S2中的培养瓶I中长满细胞后(培养2-3周后)，使用无钙、镁离子的PBS洗两遍，再加入0.05％胰蛋白酶消化30-120秒，弃去培养瓶I和没有消化下来的细胞，得消化产物II，将消化产物II转入新的25cm2培养瓶II中，37℃，5％CO2培养3-9小时后，弃去培养基和没本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、采用胶原酶P一步消化小鼠脾脏碎块，消化30-50分钟，得消化产物I；/nS2、将消化产物I用5ml吸头吹打1分钟后静置1分钟，吸取上清消化产物，按照比例1:1，加入4℃预冷的营养液，设置离心温度为4℃，离心转速为300g，离心5分钟后弃去上清液，获得细胞沉淀物，将细胞沉淀物用营养液悬浮，然后接种于25cm

【技术特征摘要】
1.一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采用胶原酶P一步消化小鼠脾脏碎块，消化30-50分钟，得消化产物I；
S2、将消化产物I用5ml吸头吹打1分钟后静置1分钟，吸取上清消化产物，按照比例1:1，加入4℃预冷的营养液，设置离心温度为4℃，离心转速为300g，离心5分钟后弃去上清液，获得细胞沉淀物，将细胞沉淀物用营养液悬浮，然后接种于25cm2培养瓶I中，37℃，5％CO2贴壁12小时后，弃去培养液，贴壁细胞使用DMEM洗两遍后，加入6ml营养液37℃，5％CO2培养，培养过程中每3-7天换一次营养液，且每次换液前用DMEM洗贴壁细胞两次；
S3、待步骤S2中的培养瓶I中长满细胞后，使用无钙、镁离子的PBS洗两遍，再加入0.05％胰蛋白酶消化30-120秒，得消化产物II，将消化产物II转入新的25cm2培养瓶II中，37℃，5％CO2培养3-9小时后，弃去培养基和没有贴壁的细胞，往培养瓶II中加入6ml营...

【专利技术属性】
技术研发人员：李家斌，李嘉嘉，刘艳艳，魏艳艳，胡立芬，伍婷，
申请(专利权)人：安徽医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：安徽;34