一种多能干细胞的建立与干性维持方法技术

本发明专利技术公开了一种多能干细胞的建立与干性维持方法，包括以下步骤，步骤一：选择合适母体细胞；步骤二；提取母体细胞，对细胞进行培养，选取健康母体细胞；步骤三：对母体细胞进行处理，获取新型多能干细胞；本发明专利技术通过采用不同浓度的bHLH转录因子对多能干细胞分化情况进行抑制，并通过设置不同浓度梯度的bHLH转录因子对多能干细胞进行探究，从而能够确认出具体浓度的bHLH转录因子对干细胞分化的影响情况，通过这种方式能够实现将多能干细胞放置在含有具体浓度的bHLH转录因子培养液内，实现对多能干细胞干性的维持，从而能够使多能干细胞适用于后续疾病机制、模型制备、染色体工程、基因组稳定性等生物学或医学研究。

【技术实现步骤摘要】
一种多能干细胞的建立与干性维持方法
本专利技术属于多能干细胞
，具体涉及一种多能干细胞的建立与干性维持方法。
技术介绍
多能干细胞(PluripotentStemCells)是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种APSC多能细胞，多能干细胞(HSC)具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。多能干细胞(Pluripotentstemcell，Ps)是当前干细胞研究的热点和焦点。它可以分化成体内所有的细胞，进而形成身体的所有组织和器官。因此，多能干细胞的研究不仅具有重要的理论意义，而且在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值。多能干细胞(pluripotentstemcell)，具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。2009年6月3日中国科学家肖磊领导的科研小组首次从猪的体细胞中培育出多能干细胞，这也是世界上首次提取出家养有蹄类动物的多能干细胞。在多能干细胞研究过程中，并没有利用多能干细胞开展疾病机制、模型制备、染色体工程、基因组稳定性等生物学或医学研究，针对哺乳动物细胞倍性调控、染色体重构、复杂疾病发生等问题，因此对于多能干细胞的研究还需要更深层次的探究。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种多能干细胞的建立与干性维持方法，以解决上述
技术介绍
中提出的没有对多能干细胞进行深层次探究的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种多能干细胞的建立与干性维持方法，包括无菌培养箱和以下步骤，步骤一：选择合适母体细胞；步骤二；提取母体细胞，对细胞进行培养，选取健康母体细胞；步骤三：对母体细胞进行处理，获取新型多能干细胞；步骤四：对新型多能干细胞进行培养，筛选健康新型多能干细胞：步骤五：对多能干细胞采用基因修饰技术，导入较容易标记的目标DNA；步骤六：分别对基因修饰后的新型多能干细胞进行诱导分化和抑制分化实验，并分别设置不同对照组实验；步骤七：对分化后的细胞采用免疫染色确定修饰基因表达情况，并对数据进行记录。优选的，所述步骤一中，从健康年轻供体采集骨髓或从健康产妇采集脐带。优选的，所述步骤二中，采用机械剪切的方法，将母体细胞组织剪切为细小组织，并将剪切后的细胞组织采用原代建系、重编程和胚胎分离等技术手段获取新型多能干细胞。优选的，所述步骤四中，提前备好细胞培养皿，向培养皿内加入小牛血清，并加入激素、微量元素、矿物质和脂肪等营养物质，细胞增殖后，光学显微镜下观察细胞生长情况并拍照，每4天换液，弃除不贴壁的细胞，到细胞生长至80％融合状态时，用trypsin/EDTA消化传代细胞，并筛选健多能干细胞。优选的，所述步骤五中，选取多能干细胞，并对多能干细胞采用基因修饰技术，向多能干细胞内基因内导入Oct-4，Nanog-3，Sox-2目标基因。优选的，所述步骤六中，使用相同浓度的转化生长因子-β诱导多能干细胞分化，并将该组设为实验组，对照组不采用转化生长因子。优选的，所述步骤六中，分别采用浓度范围为0.5-2mol/LbHLH转录因子对多能干细胞进行分化抑制，对照组不采用bHLH转录因子。优选的，所述步骤七中，对不同实验组内分化后的多能干细胞采用PCR对Oct-4，Nanog-3，Sox-2修饰基因进行检测，并将表达和未表达的基因进行数据记录。优选的，所述无菌培养箱下表面四角均转动连接有移动轮，所述无菌培养箱上端一侧固定连接有扶手，所述无菌培养箱一侧通过铰链铰接有密封门，所述密封门一侧固定连接有把手，所述无菌培养箱一侧设置有显示器，所述显示器上下两端均设置有观察窗口。优选的，所述无菌培养箱内部中间固定连接有分隔板，所述分隔板和无菌培养箱上表面均设置有存放皿，所述无菌培养箱内部一侧上下两端均设置有加温板，所述无菌培养箱内部两侧均设置有紫外线灯，所述紫外线灯数量设置为四个。与现有技术相比，本专利技术提供了一种多能干细胞的建立与干性维持方法，具备以下有益效果：1、本专利技术通过采用不同浓度的bHLH转录因子对多能干细胞分化情况进行抑制，并通过设置不同浓度梯度的bHLH转录因子对多能干细胞进行探究，从而能够确认出具体浓度的bHLH转录因子对干细胞分化的影响情况，通过这种方式能够实现将多能干细胞放置在含有具体浓度的bHLH转录因子培养液内，实现对多能干细胞干性的维持，从而能够使多能干细胞适用于后续疾病机制、模型制备、染色体工程、基因组稳定性等生物学或医学研究；2、本专利技术通过对母体细胞进行原代培养、重编程和胚胎分离的技术，能够对母体细胞进行初代培养，从而能够使母体细胞产生增殖和和分化效果更好的母体细胞，从而能够为后续实验提供较好的原细胞，增加了实验的真实性；3、本专利技术通过采用免疫染色的方法，能够通过显微镜对细胞内染色位置进行观察的方法，能够确定修饰基因表达情况，从而能够确定修饰基因的具体分化位置，通过采用转化生长因子-β诱导多能干细胞分化，能够促进多能干细胞的分化效果，从而能够方便研究人员观察修饰基因表达情况。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制，在附图中：图1为本专利技术提出的多能干细胞的建立与干性维持方法中获取多能干细胞的系统框架图；图2为本专利技术提出的多能干细胞的建立与干性维持方法中多能干细胞干性维持方法的系统框架图；图3为本专利技术提出的多能干细胞的建立与干性维持方法中多能干细胞干性维持方法中无菌培养箱的结构示意图；图4为本专利技术提出的多能干细胞的建立与干性维持方法中多能干细胞干性维持方法中无菌培养箱的剖视图；具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。请参阅图1-4，本专利技术提供以下技术方案：一种多能干细胞的建立与干性维持方法，包括无菌培养箱1和以下步骤，步骤一：选择合适母体细胞；步骤二；提取母体细胞，对细胞进行培养，选取健康母体细胞；步骤三：对母体细胞进行处理，获取新型多能干细胞；步骤四：对新型多能干细胞进行培养，筛选健康新型多能干细胞：步骤五：对多能干细胞采用基因修饰技术，导入较容易标记的目标DNA；步骤六：分别对基因修饰后的新型多能干细胞进行诱导分化和抑制分化实验，并分别设置不同对照组实验；步骤七：对分化后的细胞采用免疫染色确定修饰基因表达情况，并对数据进行记录。本专利技术中，优选的，步骤一中，从健康年本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多能干细胞的建立与干性维持方法，包括无菌培养箱(1)和以下步骤，其特征在于：步骤一：选择合适母体细胞；/n步骤二；提取母体细胞，对细胞进行培养，选取健康母体细胞；/n步骤三：对母体细胞进行处理，获取新型多能干细胞；/n步骤四：对新型多能干细胞进行培养，筛选健康新型多能干细胞：/n步骤五：对多能干细胞采用基因修饰技术，导入较容易标记的目标DNA；/n步骤六：分别对基因修饰后的新型多能干细胞进行诱导分化和抑制分化实验，并分别设置不同对照组实验；/n步骤七：对分化后的细胞采用免疫染色确定修饰基因表达情况，并对数据进行记录。/n

【技术特征摘要】
1.一种多能干细胞的建立与干性维持方法，包括无菌培养箱(1)和以下步骤，其特征在于：步骤一：选择合适母体细胞；
步骤二；提取母体细胞，对细胞进行培养，选取健康母体细胞；
步骤三：对母体细胞进行处理，获取新型多能干细胞；
步骤四：对新型多能干细胞进行培养，筛选健康新型多能干细胞：
步骤五：对多能干细胞采用基因修饰技术，导入较容易标记的目标DNA；
步骤六：分别对基因修饰后的新型多能干细胞进行诱导分化和抑制分化实验，并分别设置不同对照组实验；
步骤七：对分化后的细胞采用免疫染色确定修饰基因表达情况，并对数据进行记录。


2.根据权利要求1所述的一种多能干细胞的建立与干性维持方法，其特征在于：所述步骤一中，从健康年轻供体采集骨髓或从健康产妇采集脐带。


3.根据权利要求1所述的一种多能干细胞的建立与干性维持方法，其特征在于：所述步骤二中，采用机械剪切的方法，将母体细胞组织剪切为细小组织，并将剪切后的细胞组织采用原代建系、重编程和胚胎分离等技术手段获取新型多能干细胞。


4.根据权利要求1所述的一种多能干细胞的建立与干性维持方法，其特征在于：所述步骤四中，提前备好细胞培养皿，向培养皿内加入小牛血清，并加入激素、微量元素、矿物质和脂肪等营养物质，细胞增殖后，光学显微镜下观察细胞生长情况并拍照，每4天换液，弃除不贴壁的细胞，到细胞生长至80％融合状态时，用trypsin/EDTA消化传代细胞，并筛选健多能干细胞。


5.根据权利要求1所述的一种多能干细胞的建立与干性维持方法，其特征在于：所述步骤五中，选取多能干细胞，并对多能干细胞采用基因修饰技术，向多能干细胞内...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭伟群，曹小伍，曹得明，邵草品，雷铭轩，
申请(专利权)人：杭州憶盛医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33