一种囊泡及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种囊泡及其应用。所述囊泡的来源包括干细胞或体细胞，具有的标志物包括Syntaxin 4，所述囊泡为诱导性囊泡。本发明专利技术的囊泡与MSCs中的外泌体相比，能特异性高表达Syntaxin 4，可用于区分MSCs来源的囊泡和Exosomes的特征性标志物。本发明专利技术制备囊泡的方法产量丰富，单个MSCs能够产出300‑2000个囊泡，制备流程简单，耗时短，对试剂和设备的要求低，治疗效果好。所述囊泡能够在体外发挥显著的促凝作用，体内注射后能够显著改善血友病小鼠的出血倾向，可用于改善血友病出血倾向的治疗。且所述囊泡可以通过皮肤和毛发排出，在体内具有安全性，因此，本发明专利技术所述的囊泡具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种囊泡及其应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种囊泡及其应用。
技术介绍
细胞外囊泡(extracellularvesicles,EVs)是细胞分泌的含有蛋白质、核酸及各种细胞因子的纳米级载体。细胞外囊泡可以通过内分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞，在细胞间物质传递和信息交流过程中发挥了重要作用。研究发现，细胞外囊泡所介导的信息交流在机体生理或病理过程中发挥了重要的调控作用，涉及到免疫调节、肿瘤生长、血管生成、损伤修复等。目前该领域的研究主要集中在外泌体(exosomes)方向。外泌体是直径在30-150nm左右的细胞外囊泡，其内含有RNA、脂质和蛋白质等成分。外泌体广泛参与了机体的各种生理/病理性调控，能够用作多种疾病的诊断、治疗和预后评估。迄今为止，间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)被认为是产生外泌体能力最强的细胞。众多的研究发现MSCs来源的外泌体能模拟MSCs的生物学功能，在促进细胞生长和分化，修复组织缺损等方面发挥了重要的调控作用。因此，近年来以MSCs来源的外泌体为基础的细胞囊泡疗法取得了显著的发展。然而，目前以外泌体为基础的细胞囊泡治疗仍然存在诸多问题，主要表现在外泌体的提取和纯化过程复杂，耗时长，对设备和试剂的要求较高，生理性外泌体产量较低等等，这些缺陷都限制了外泌体治疗的临床转化和应用。血友病(hemophilia)为一组遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，其共同的特征是活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创伤后出血倾向，重症患者没有明显外伤也可发生“自发性”出血。2018年5月11日，国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》，血友病被收录其中。血友病主要分为三类，即血友病A，血友病B和血友病C。血友病A，即因子Ⅷ促凝成分(Ⅷ：C)缺乏症，是一种性联隐性遗传疾病，女性传递，男性发病。血友病B，即因子Ⅸ(FIX)缺乏症，亦为性联隐性遗传，其发病数量较血友病A少。血友病C，即因子Ⅺ(FⅪ)缺乏症，为常染色体不完全隐性遗传，是一种罕见的血友病。发病率以血友病A最多占80％-85％，血友病B占15％-20％，血友病C很少见。长期以来，针对血友病的治疗，临床上以注射外源性凝血因子做为主要干预措施，但该方法存在治疗成本高、治疗有效期短、易产生自身抗体等各种问题，无法成为切实有效的治疗手段。
技术实现思路
一些实施方案中，本专利技术提供了一种来源于间充质干细胞的囊泡。一些实施方案中，本专利技术提供了一种囊泡组合物。一些实施方案中，本专利技术提供了一种针对血友病的、包含囊泡的药物组合物。一些实施方案中，本专利技术提供了一种囊泡的筛选或者鉴定或者提取试剂盒。一些实施方案中，本专利技术提供了一种囊泡的标志物。一些实施方案中，本专利技术提供了一种利用标志物对囊泡进行鉴定或者选择的方法。一些实施方案中，本专利技术提供了一种囊泡的制备方法。一些实施方案中，本专利技术提供了一种来源于体细胞或干细胞的囊泡，所述囊泡是诱导性囊泡，所述囊泡具有的标志物包括Syntaxin4。在一些实施方案中，所述干细胞包括全能干细胞和多能干细胞。在一些实施例中，所述干细胞包括间充质干细胞和诱导性多能干细胞(IPS)。一些实施方案中，所述的体细胞包括成骨细胞系。一些实施方案中，所述细胞可以是原代培养的细胞，也可以是已有的或已确立的细胞系。一些实施方案中，所述细胞系指的是是指永生化的细胞培养物，在适当的新鲜培养基和空间下可以无限增殖。一些实施方案中，所述细胞可以是确立细胞株。一些实施方案中，所述诱导性囊泡是在所述干细胞或体细胞处于正常存活期间通过外力诱导凋亡而产生的囊泡。一些实施方案中，所述诱导性囊泡是通过添加星形孢菌、紫外线照射、饥饿法、或热应力法或其中一种或多种的组合诱导干细胞或干细胞凋亡产生。一些实施方案中，所述囊泡具有的标志物还包括AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11、Integrinalpha5中的一种或几种。一些实施方案中，所述囊泡具有标志物Syntaxin4、AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11和Integrinalpha5的组合。一些实施方案中，所述囊泡高表达标志物AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11、Integrinalpha5和Syntaxin4。一些实施方案中，所述囊泡对标志物AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11、Integrinalpha5和Syntaxin4的表达量高于MSC或外泌体。一些实施方案中，所述囊泡中的标志物AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11、Integrinalpha5和Syntaxin4的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1-2倍、2-3倍、1-3倍、3-4倍和3-6倍。一些实施方案中，所述囊泡中的标志物AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11、Integrinalpha5和Syntaxin4的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1.5-2倍、2.5-3倍、1.5-2.5倍、3.5-4倍和3.5-5倍。在一些实施例中，所述囊泡中的标志物AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11、Integrinalpha5和Syntaxin4的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1.5-1.9倍、2.5-2.9倍、1.8-2.5倍、3.5-3.9倍和4-5倍。一些实施方案中，所述囊泡中的标志物AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11、Integrinalpha5和Syntaxin4的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1.76倍、2.81倍、2.41倍、3.68倍和4.45倍。一些实施方案中，所述外泌体不表达Syntaxin4，本专利技术的囊泡表达Syntaxin4。一些实施方案中，所述外泌体不同时表达AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11、Integrinalpha5和Syntaxin4，本专利技术的囊泡同时表达AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11、Integrinalpha5和Syntaxin4。一些实施方案中，所述囊泡和所述外泌体来源于同种来源的MSCs。一些实施方案中，利用流式细胞技术对IEVs的表面膜蛋白进行分析，结果显示，MSCs来源的IEVs能够表达和MSCs相似的表面蛋白，即CD29,CD44,CD73,CD166阳性，CD34,CD45阴性；同时，IEVs能够表达细胞外囊泡的普遍性表面蛋白CD9,CD63,CD81和C1q。一些实施方案中，所述诱导性囊泡是通过添加星形孢菌素、紫外线照射、饥饿法、热应力法或其组合诱导间充质干细胞凋亡产生。一些实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种囊泡，其特征在于，所述囊泡是诱导性囊泡，所述囊泡的细胞来源包括干细胞或体细胞；所述的囊泡具有的标志物包括Syntaxin 4。/n

【技术特征摘要】
20200120 CN 20201006615461.一种囊泡，其特征在于，所述囊泡是诱导性囊泡，所述囊泡的细胞来源包括干细胞或体细胞；所述的囊泡具有的标志物包括Syntaxin4。


2.如权利要求1所述的囊泡，其特征在于，所述体细胞包括原代培养的细胞或细胞系；
优选地，所述的体细胞包括成骨细胞系；
更为优选地，所述细胞系指的是是指永生化的细胞培养物，在适当的新鲜培养基和空间下可以无限增殖；
优选地，所述干细胞包括全能干细胞和多能干细胞；
优选地，所述干细胞包括间充质干细胞和诱导性多能干细胞；
优选地，所述诱导性囊泡是在所述干细胞或体细胞处于正常存活期间通过外力诱导凋亡而产生的囊泡；
优选地，所述诱导性囊泡是通过添加星形孢菌、紫外线照射、饥饿法、或热应力法或其中一种或多种的组合诱导干细胞或干细胞凋亡产生；
优选地，所述囊泡具有的标志物还包括AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11、Integrinalpha5中的一种或几种；
进一步优选地，所述囊泡具有标志物Syntaxin4、AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11和Integrinalpha5的组合；
进一步优选地，所述囊泡高表达标志物AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11、Integrinalpha5和Syntaxin4；
或优选地，所述囊泡对标志物AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11、Integrinalpha5和Syntaxin4的表达量高于MSC或外泌体；
或优选地，所述囊泡中的标志物AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11、Integrinalpha5和Syntaxin4的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1-2倍、2-3倍、1-3倍、3-4倍和2-6倍；
更为优选地，所述囊泡中的标志物AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11、Integrinalpha5和Syntaxin4的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1.5-2倍、2.5-3倍、1.5-2.5倍、3.5-4倍和3.5-5倍；
更进一步优选地，所述囊泡中的标志物AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11、Integrinalpha5和Syntaxin4的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1.5-1.9倍、2.5-2.9倍、1.8-2.5倍、3.5-3.9倍和4-5倍；
更进一步优选地，所述囊泡和所述外泌体来源于同种来源的MSCs；
或优选地，所述囊泡还表达CD29、CD44、CD73、CD166；且不表达CD34、CD45；
或优选地，所述囊泡还表达CD9、CD63、CD81和C1q中的一个或多个；
或优选地，所述的囊泡是用星形菌素诱导间充质干细胞产生的；
优选地，所述星形孢菌素的浓度为1nM-10000nM；
优选地，所述星形孢菌素的浓度为100nM-10000nM；
优选地，所述星形孢菌素的浓度为500nM-10000nM；
优选地，所述星形孢菌素的浓度为500-1000nM；
进一步优选地，所述星形孢菌素的浓度为500-900nM；
进一步优选地，所述星形孢菌素的浓度为500-800nM。


3.如权利要求1所述的囊泡，其特征在于，所述囊泡的直径为0.03-6μM；
优选地，所述囊泡的直径为0.03-4.5μM；
进一步优选地，所述囊泡的直径为0.03-1μM；
进一步优选地，所述囊泡的直径为0.04-1μM；
进一步优选地，所述囊泡的直径为0.05-1μM；
进一步优选地，所述囊泡的直径为0.1-1μM；
进一步优选地，所述囊泡的直径为0.15-1μM。


4.一种囊泡组合，其特征在于，包含权利要求1-3任一所述的囊泡；
优选地，权利要求1-3任一所述的囊泡在所述囊泡组合中的数目占比为65-100％；
进一步优选地，权利要求1-3任一所述的囊泡在所述囊泡组合中的数目占比为75-98％；更为优选地，权利要求1-3任一所述的囊泡在所述囊泡组合物中的数目占比为80-96％；
或优选地，所述囊泡组合还包含外泌体、迁移体、微泡和Ectosome中的一种或几种。


5.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1-3任一所述的囊泡；或者包含权利要求4所述囊泡组合；
优选地，所述组合物包括药品、食品、保健品、化妆品、添加剂或中间品；
优选地，所述组合物为药品；
优选地，所述组合物还包含药学上或免疫学上可接受的载体；
更为优选地，所述组合物的制剂形式选自冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊、试剂盒或贴剂。


6.一种囊泡的筛选或者鉴定或者提取试剂或试剂盒，其特征在于，包含标志物AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin11、Integrinalpha5和Syntaxin4中的一种或多种的检测试剂；
优选地，所述检测试剂检测所述标志物基因的表达量；
进一步优选地，所述检测试剂检测所述标志物mRNA的表达量；
更为优选地，所述标志物的检测试剂检测所述标志物蛋白的表达量；
或优选地，所述标志物的检测试剂为荧光定量PCR染料、荧光定量PCR引物、荧光定量PCR探针、抗体、抗体功能性片段和偶联抗体中的一种或多种；
或优选地，所述试剂盒选自qPCR试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒和ELISA试剂盒中的一种或多种；
更为优选地，所述试剂盒选自流式细胞分析试剂盒；
优选地，所述囊泡为诱导性囊泡。


7.一种选择或鉴定...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓，寇晓星，施松涛，
申请(专利权)人：医微细胞生物技术广州有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44