一种猪胃底腺干细胞分离及三维类器官培养方法技术

本发明专利技术公开了一种猪胃底腺干细胞分离及三维类器官培养方法，所述方法包括胃底腺干细胞的解离分离、配制猪胃类器官培养基和三维胃类器官培养三个部分。本发明专利技术填补了胃类器官技术在猪营养研究中的空白，为单胃动物的胃营养功能研究提供新的工具与载体。

【技术实现步骤摘要】
一种猪胃底腺干细胞分离及三维类器官培养方法
本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种猪胃底腺干细胞分离及三维类器官培养方法。
技术介绍
动物营养研究的核心问题是如何提高日粮蛋白到动物蛋白的转化率，而胃是消化系统中承担日粮初步处理与分解的主要器官，研究其营养功能对于提高饲料利用率具有重要意义。对于单胃动物如猪来说，胃分区主要包括幽门腺区、胃底腺区、无腺部、贲门腺区。胃的组织结构分为四层,由腔面向外依次为黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层。黏膜层的最内层是单层柱状上皮,单层柱状上皮向内凹陷,形成长的管状腺,管状腺再细分为凹部、峡部、颈部和基底部。通过lgr5免疫荧光标记发现胃的干细胞主要位于胃底部管状腺的基底部。与肠粘膜上皮更细机制类似，正常情况下，胃粘膜上皮每3-7天更新一次以维持胃粘膜细胞的动态更替。胃粘膜损伤后，上皮细胞增生加速，以促进损伤愈合，维持胃粘膜完整性。胃lgr5阳性干细胞在胃粘膜细胞更新与功能维持方面起到了决定性作用。在医学消化的胃研究中，已经广泛建立了正常胃粘膜细胞系如RGM-1和GES-1和胃癌细胞系如取自胃癌原发灶M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪胃底腺干细胞分离及三维类器官培养方法，其特征在于，所述方法包括如下A、B和C三个部分：/nA、分离胃底腺干细胞：/n(1)配制5X冲洗液母液和1X冲洗液，每100mL所述5X冲洗液母液由Na

【技术特征摘要】
1.一种猪胃底腺干细胞分离及三维类器官培养方法，其特征在于，所述方法包括如下A、B和C三个部分：
A、分离胃底腺干细胞：
(1)配制5X冲洗液母液和1X冲洗液，每100mL所述5X冲洗液母液由Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、蔗糖和山梨糖醇配制而成；所述Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、蔗糖和山梨糖醇在5X冲洗液母液中的浓度分别为28、40、481、8、217和274.5mM；所述1X冲洗液由5X冲洗液母液用灭菌水稀释而成，并添加二硫代苏糖醇，所述Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、蔗糖、山梨糖醇和二硫代苏糖醇在1X冲洗液中的浓度分别为5.6、8.0、96.2、1.6、43.4和54.9mM和0.5mM；4℃保存备用；将24孔细胞培养板于37℃预热30min以上，冰上解冻基质胶，备用；
(2)将新鲜的2～3cm2胃组织放入装有冲洗液的培养皿里，用冲洗液洗掉胃组织的污物，然后将胃组织转移到新的装有冲洗液的培养皿内继续清洗2～3次；
(4)将清洗干净的胃组织移到新的干燥的培养皿，剔除黏膜层和肌肉层，然后将含有基底腺的部分放到新的装有冲洗液的培养皿里，用冲洗液冲洗并吸走残余肌肉层和其他杂脂肪；吸走培养皿中的冲洗液，加入新的冲洗液到培养皿，将含有基底腺部分的胃组织片段剪切成2～5mm2的胃组织碎片；
(5)将胃组织碎片转移到50mL无菌无酶离心管中，向离心管中加入冲洗液，使胃组织碎片随重力沉降，弃去上清部分；重复此操作12次以上，至上清干净透明；
(6)将15～25℃20mL温和型解离液加入经步骤(5)处理后的离心管中，重悬胃组织碎片，在200rpm摇床条件下解离15～30min；重悬解离后的胃组织碎片，使胃组织碎片随重力沉降，弃去上清部分，将胃组织碎片沉淀转移到新的培养皿里，用载玻片轻轻按压，分离出未脱落的基底腺体结构，用冲洗液悬浮基底腺体结构；
(7)将重悬的基底腺体结构转移至50mL无菌无酶离心管，使基底腺体结构随重力沉降，弃去上清部分，然后加入新的15～25℃温和型解离液，在200rpm摇床条件下继续解离5～8min，然后在200g，2～8℃，离心3～5min，弃去上清部分；用15mLF12高糖培养基重悬沉淀，吸取10mL悬浮液通过100μm细胞筛网过滤，重复此步骤，获得2～3份滤液；吸取200μl滤液均匀涂抹到6孔细胞培养板的小室内，显微镜下观察，找到含有干细胞结构较多、碎细胞少的滤液，在300g，2～8℃，离心3～5min，弃去上清部分，即得胃底腺含有干细胞的组织结构；
B、配制猪胃类器官培养基：
(8)配制猪胃类器官培养基：所述猪胃类器官培养基由F12高糖培养基、HEPES缓冲液、谷氨酰胺、B27血清替代物、N-乙酰半胱氨酸、EGF、FGF-10、TGF-βI型受体抑制剂、尼克酰胺、乙醇胺、胃泌素I、Rock激酶抑制剂、Wnt3A条件培养基、WNR-J2条件培养基组成；所述F12高糖培养基、HEPES缓冲液、谷氨酰胺、B27血清替代物、N-乙酰半胱氨酸、EGF、FGF-10、TGF-βI型受体抑制剂、尼克酰胺、乙醇胺、胃泌素I、Rock激酶抑制剂、Wnt3A条件培养基、WNR-J2条件培养基在猪胃类器官培养基中的浓度或体积百分比含量分别为：HEPES缓冲液10～15mM、谷氨酰胺2mM、B27血清替代物1％、N-乙酰半胱氨酸1mM、EGF50ng/mL、FGF-10200ng/mL、TGF-βI型受体抑制剂2μM、尼克酰胺10mM、乙醇胺10μM、胃泌素I10mM、Rock激酶抑制剂10μM、Wnt3A条件培养基40～50％、WNR-J2条件培养基10～20％，其余为F12高糖培养基；
其中，所述Wnt3A条件培养基的制备过程如下：
a)解冻一份液氮冻存的ATCC-L-Wnt3a细胞；用DMEM+10％胎牛血清FBS+0.4mg/mLG418配制成L-Wnt3a基础培养基；
b)将15mL新鲜配制的L-Wnt3a基础培养基加入到T75培养瓶中，加入解冻的L-Wnt3a细胞，放入37℃，5％CO2培养箱，持续培养直到贴满；
c)将L-Wnt3a传代到4个新的T75培养瓶中，每个瓶子同样添加10mL的新鲜配制的L-Wnt3a基础培养基，继续培养2～3d，直到贴满；
d)收获每个T75瓶贴满后的培养基，每隔24h收集一次，将收获的培养基以1000g、2～8℃条件下离心3～5min；收集上清液，通过0.22μm细胞筛网过滤到新的50mL无菌无酶离心管，得过滤后的培养基；
e)将收获的过滤后的培养基充分混合即Wnt3a条件培养基，按25mL每50mL离心管分装，于-80℃冰箱保存，备用；
所述WNR-J2条件培养基的制备过程如下：
a)制备JM培养基：将猪血清、DMEM高糖培养基和青霉素/链霉素双抗按体积比1:(3～4)：(0.005～0.015)混匀，于4℃保存备用；
b)将10mLJM培养基于37℃水浴预热后转移至T25培养瓶；
c)将冻存的WNR-J2细胞于37℃水浴进行解冻，得WNR-J2细胞溶液；
d)将WNR-J2细胞溶液转移至步骤b)准备的装有JM培养基的T25培养瓶，于37℃、5％CO2培养箱连续培养2～3d，至细胞完全长满T25培养瓶贴壁融合为止；
e)移除T25培养瓶中的JM培养基；
f)向移除JM培养基后的T25培养瓶中加入1mL温和型无酶解离液，使温和型无酶解离液均匀覆盖T25培养瓶内壁的细胞层表面，于37℃培养箱解离5～8min；
h)在7℃下预热25mL新的JM培养基，并用6mL预热后的JM培养基重选T25培养瓶中的细胞，得细胞悬液，然后将细胞悬液转移至T150培养瓶，再将预热的剩余的19mLJM培养基加入T150培养瓶，于37℃，5％CO2培养箱培养24h；
i)经步骤h)培养后，移除JM培养基，然后加入25mLSM筛选培养基培养24h，剔除非WNR-J2细胞；
j)经步骤i)培养后，更换SM筛选培养基为25mL新的JM培养基，继续培养WNR-J2细胞，至WNR-J2细胞完全长满T150培养瓶贴壁融合为止；
k)经步骤j)培养后，移除旧的JM培养基，加入120...

【专利技术属性】
技术研发人员：周健，熊霞，万丹，邵宜锐，吴宇梁，印遇龙，
申请(专利权)人：中国科学院亚热带农业生态研究所，
类型：发明
国别省市：湖南;43