一种异质性干细胞群、其制备方法及用途技术

本发明专利技术涉及一种异质性干细胞群、其制备方法及用途。具体地，本发明专利技术涉及一种异质性干细胞群，其特征在于所述异质性干细胞群中的干细胞表达干性基因MYC、KLF4、GMNN、SOX2和NANOG，并且在所述异质性干细胞群中，表达CD146的干细胞的比率为1％‑50％。

【技术实现步骤摘要】
一种异质性干细胞群、其制备方法及用途
本专利技术涉及一种新的异质性干细胞群，其特征在于成体组织内找到的由胚胎发育后存留的干细胞群体，其表达全能基因c-Myc、Gmnn和Klf4，并且在该混合的异质性干细胞群中，CD146的表达率为1-100％。本专利技术还涉及所述异质性干细胞群的制备方法及其用途。
技术介绍
间充质干细胞(MSC)，或者可以定义为多能间充质基质细胞，是异质细胞群(Uccelli等，2008)。MSC的发现通常归功于A.J.的工作。20世纪60年代后期的弗里登斯坦及其同事观察到在塑料培养皿中培养人骨髓(BM)细胞悬浮液导致造血对应物逐渐丧失，有利于增殖粘附的成纤维细胞样细胞集落，能够分化成脂肪细胞、体外(Friedenstein等，1968)、体内(Friedenstein等，1974)、软骨细胞和骨细胞。首字母缩略词“MSC”在A.I.的工作后开始流行。Caplan等人在1991年提交的文章中提出在成人BM中，干细胞群可以分化成源自中胚层的不同组织的谱(Caplan，1991)。他们将这些细胞称为“间充质干细胞”。后来，Pittenger明确证明了MSC的多向分化能力(Pittenger等，1999)。从这些开创性的研究结果来看，培养扩增的MSC成为许多研究的对象，甚至对这些细胞的确切表征还有待阐明，并且在不同的实验室中没有应用标准化方案。因此，报告的数据有时是有争议的，并且MSC生物学的许多方面仍然不清楚，这是因为分离程序的多样性、培养方法和组织来源的选择。为了更好地阐明围绕MSC的争议，我们提出了间充质干细胞系统的概念，该系统由来自胚胎发育的不同阶段的所有MSC组成，从胚胎后的后代细胞干细胞到祖细胞。MSC系统的顶部是胚胎样干细胞，即使在胎儿形成后仍留在许多组织中，我们将它们定义为胚胎后多能干细胞(PSC)。我们鉴定了来自多种人胎儿和成人组织的PSC，并证明这些细胞可以产生内皮细胞、肝上皮细胞、神经细胞、造血细胞、成脂细胞和成骨细胞系。PSC现已被其他团体证实。2010年，KurodaY等人在单细胞水平证明成体间充质干细胞(MSC)含有一种独特类型的干细胞，能够产生具有所有三个胚层特征的细胞。这些细胞被称为多谱系分化胁迫耐受(Muse)细胞。从脂肪组织中分离出高度纯化的Muse细胞群，并报道其自发分化为间充质、内胚层和外胚层细胞谱系。所有这些研究都表明成人组织中存在PSC。我们假设MSC系统中的其他细胞如周细胞和一般MSC是PSC的衍生物。PSC的定义是从干细胞分化的角度出发的。通过多年对这种细胞类型的研究，我们强烈提倡干细胞功能定义的思想。在这里，我们将PSC定义为培养活化的胚后亚多能干细胞(CAPPSC)，其具有三个重要的生物学特征：干细胞特性包括多能性和自我更新，低免疫原性和免疫调节功能，微环境和组织平衡。
技术实现思路
本专利技术人的研究发现，本专利技术人提供的新干细胞群与以前报道的MSC不同，其是一组干性更强混合的异质性的干细胞群体；其处于具有表观遗传多能性的常染色质状态，并表达多潜能标记物MYC、KLF4和GMNN。与胚层规范相关的大多数基因由H3K4me3修饰或由H3K4me3和H3K27me3共修饰。通过单细胞RNA-seq解析新干细胞向功能性肝脏细胞分化的过程，也发现在分化的很早阶段，三胚层早期分化相关基因都先后上调表达，当细胞定向肝脏谱系分化后，其它胚层分化相关基因下调表达。本研究中，单细胞数据分析显示，我们体外分离培养获得的新干细胞群体，表达全能基因c-Myc、Gmnn和Klf4，表达三胚层早期发育相关基因，如外胚层的Nes和Hes1、中内胚层的Pdgfra和Gsc，限定性内胚层的Hhex和Sox17，内胚层器官肝脏发育关键基因ATF5、Tle3、Hnf4a和Krt18的表达较高，中胚层Mesp2、Gata4、Hand1和Tbx6表达很弱，但成骨分化相关基因Wnt5a、Runx2、TAZ明显表达，成脂分化相关的上游调控基因Cebpb、Cebpd、Gsk3a、Gsk3b显著表达，Mapk7中等表达，成脂分化关键转录因子Pparg和Cebpa低或不表达。有趣的是，我们发现新干细胞中，上皮——间质转换相关关键基因Tjp1、Ctnnb1、Cdh2、Fn1、Vim、Zeb1和Twist1均明显高表达，表明新干细胞处于上皮——间质转换的中间阶段，可以随着不同微环境信号刺激，发生快速的功能转换。在本专利技术的一个方面中，提供了一种异质性干细胞群，其特征在于所述异质性干细胞群中的干细胞表达干性基因MYC、KLF4、GMNN、SOX2和NANOG，并且在所述异质性干细胞群中，表达CD146的干细胞的比率为1-100％，优选地，表达CD146的干细胞的比率为1-50％。进一步地，根据本专利技术提供的异质性干细胞群，在用含有50％－99％DMEM/F12、0.1－30ng/m1表皮生长因子和0.1－2％B27、0.1－10％FBS的培养基中传代所述异质性干细胞群1代、2代、3代、4代、5代、6代、7代、8代、9代、10代或10代以上后，表达CD146的干细胞的比率为1-99％，优选地，表达CD146的干细胞的比率为1-50％。另一方面，根据本专利技术提供的异质性干细胞群，在用含有FBS的培养基传代所述异质性干细胞群1代、2代、3代、4代、5代、6代、7代、8代、9代、10代或10代以上后，表达CD146的干细胞的比率为50-100％，优选地，表达CD146的干细胞的比率为55-100％。进一步地，根据本专利技术提供的异质性干细胞群，其中表达CD146+弱阳性(其中，表达CD146的干细胞的比率为1-50％，不包括50％为CD146+弱阳性)的干细胞中的干性基因MYC、KLF4、GMNN、SOX2和NANOG的表达水平显著高于表达CD146+++强阳性(其中，表达CD146的干细胞的比率为50-100％为CD146+++强阳性)的干细胞。一种体外诱导根据本专利技术提供的异质性干细胞群分化成网状血管内皮细胞的方法，所述方法包括在含有50％－99％DMEM/F12、0.1－30ng/m1表皮生长因子和0.1－2％B27、0.1－10％FBS的培养基中诱导本专利技术提供的异质性干细胞群分化成网状血管内皮细胞。一种体外促进T细胞活化的方法，所述方法包括将根据本专利技术提供的异质性干细胞群与分离的PBMC在含有LPS的培养基中共培养的步骤。一种体外抑制T细胞活化的方法，所述方法包括将根据本专利技术提供的异质性干细胞群与分离的PBMC在含有PolyIC或IFN-γ+TNF-α(I+T)的培养基中共培养的步骤。根据本专利技术提供的异质性干细胞群在制备用于修复组织损伤的药物中的用途，优选地，所述组织损伤为肝细胞损伤。根据本专利技术提供的异质性干细胞群在制备用于治疗cGVHD的药物中的用途。一种制备本专利技术提供的异质性干细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：(1)获得干细胞群；(2)在含有50％－99％DMEM/F12、0.1－30ng/m1表皮生长因子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种异质性干细胞群，其特征在于所述异质性干细胞群中的干细胞表达干性基因MYC、KLF4、GMNN、SOX2和NANOG，并且在所述异质性干细胞群中，表达CD146的干细胞的比率为1-100％，优选地，表达CD146的干细胞的比率为1-50％；/n任选地，其中表达CD146+弱阳性的干细胞中的干性基因MYC、KLF4、GMNN、SOX2和NANOG的表达水平显著高于表达CD146+++强阳性的干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种异质性干细胞群，其特征在于所述异质性干细胞群中的干细胞表达干性基因MYC、KLF4、GMNN、SOX2和NANOG，并且在所述异质性干细胞群中，表达CD146的干细胞的比率为1-100％，优选地，表达CD146的干细胞的比率为1-50％；
任选地，其中表达CD146+弱阳性的干细胞中的干性基因MYC、KLF4、GMNN、SOX2和NANOG的表达水平显著高于表达CD146+++强阳性的干细胞。


2.根据权利要求1所述的异质性干细胞群，其特征在于在用含有50％－99％DMEM/F12、0.1－30ng/m1表皮生长因子和0.1－2％B27、0.1－10％FBS的培养基中传代所述异质性干细胞群1代、2代、3代、4代、5代、6代、7代、8代、9代、10代或10代以上后，表达CD146的干细胞的比率为1-100％，优选地，表达CD146的干细胞的比率为1-50％。


3.根据权利要求1所述的异质性干细胞群，其特征在于在用含有0.1-10％FBS的培养基传代所述异质性干细胞群1代、2代、3代、4代、5代、6代、7代、8代、9代、10代或10代以上后，表达CD146的干细胞的比率为50-100％，优选地，表达CD146的干细胞的比率为55-100％。


4.一种体外诱导根据权利要求1-3任一项所述的异质性干细胞群分化成网状血管内皮细胞的方法，所述方法包括在含有50％－99％DMEM/F12、0.1－30ng/m1表皮生长因子和0.1－2％B27、0.1－10％FBS的培养基中诱导根据权利要求1-4任一项所述的异质性干细胞群分化成网状血管内皮细胞。


5.一种体外调节T细胞活化的方法，所述方法包括将根据权利要求1-3任一项所述的异质性干细...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵春华，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11