一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法技术

本发明专利技术提供一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，包括：步骤一，小鼠肝脏类器官模型的建立：(1)取小鼠肝脏组织，依次进行清洗、剪切、消化、裂解及过滤处理，获得小鼠肝脏干细胞沉淀；(2)将小鼠肝脏干细胞制胶后采用培养基培养，获得肝脏类器官模型；步骤二，将肝脏类器官模型进行药物处理：将待测药物设置成多个浓度梯度，然后将肝脏类器官模型给予不同浓度梯度下的药物刺激，并在不同时间点收集类器官样本，观察其形态学变化并检测肝功能指标。本发明专利技术提供了一种更加准确的体外检测药物肝毒性的方法，周期短，操作简便，可代替传统细胞系模型和动物模型，用于临床前新药开发及临床药物肝毒性评估。

【技术实现步骤摘要】
一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法。
技术介绍
肝脏独特的代谢功能和与胃肠道的关系使其成为药物和外源物质毒性的重要靶标。从出生到青春期，肝脏代谢活性的变化对同种毒素有不同的敏感性。肝脏药物代谢，往往是不平衡的有毒代谢物的产生和解毒过程，可以影响肝毒性的程度。在严重毒性的情况下，患者可能会发生肝衰竭。药物性肝损伤是目前新药开发中由于安全性导致药物撤市的最常见的不良事件，在批准上市后发现的肝毒性也限制了许多药物的使用。如果存在一种体外模型可准确识别大量的具有高度特异性的肝毒性药物，对人类和实验动物而言无疑是一种巨大的福音。经典的评价药物不良反应的模型有体外二维培养的人原代肝细胞系和体内动物模型。然而，2D培养的人细胞系很容易失去其原始功能，并且其形态、生物功能、遗传等方面的表现和人体生理差异极大，有研究证实，2D和3D培养的细胞对于药物的反应差异明显，动物模型由于药物代谢与人类代谢的潜在差异而具有局限性。因此，临床前安全评价模型的缺陷，是目前新药临床本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤一，小鼠肝脏类器官模型的建立：/n(1)取小鼠肝脏组织，依次进行清洗、剪切、消化及过滤处理，获得小鼠肝脏干细胞；/n(2)将小鼠肝脏干细胞制胶后采用培养基培养，获得肝脏类器官模型；/n步骤二，将肝脏类器官模型进行药物处理：/n将待测药物设置成多个浓度梯度，然后将肝脏类器官模型给予不同浓度梯度下的药物刺激，并在不同时间点收集类器官样本，观察其形态学变化并检测肝功能指标。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一，小鼠肝脏类器官模型的建立：
(1)取小鼠肝脏组织，依次进行清洗、剪切、消化及过滤处理，获得小鼠肝脏干细胞；
(2)将小鼠肝脏干细胞制胶后采用培养基培养，获得肝脏类器官模型；
步骤二，将肝脏类器官模型进行药物处理：
将待测药物设置成多个浓度梯度，然后将肝脏类器官模型给予不同浓度梯度下的药物刺激，并在不同时间点收集类器官样本，观察其形态学变化并检测肝功能指标。


2.根据权利要求1所述的一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述清洗处理包括：采用含1％青链双抗的生理盐水反复进行数次，直至剔除明显的脂肪组织。


3.根据权利要求1所述的一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述消化处理包括：①将剪切好的组织分散在生理盐水中，离心去上清后往沉淀中加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化30min，加入含1％青链双抗的生理盐水终止消化，静置，收集细胞沉淀；②继续往沉淀内加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化2h，加入含1％双抗的青链生理盐水终止消化，静置沉淀，收集上清。


4.根据权利要求1所述的一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述过滤处理包括：将消化处理获得的上清液经100μm的滤网过滤，收集滤液，将滤液于常温下1000～1200rpm离心5min，收集肝脏干细胞沉淀。


5.根据权利要求1所述的一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述将小鼠肝脏干细胞沉淀制胶，具体包括：通过AdvancedDMEM/F12重悬过滤后的细胞沉淀，取Matrigel胶于4℃融化过夜，与细胞悬液充分混匀后静置。


6.根据权利要求5所述的一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述将小鼠肝脏干细胞沉淀制胶后采用培养基培养，具体包括：采用以下终浓度组分组成的培养基：不含Vit-A的B27，1-2X；EGF，45-55ng/ml；Gastrin，8-12nM；HGF，50-55ng/ml；N-acetylcysteine，1-2mM；R-spondin1，90-110ng/ml；FGF10，100-120ng/ml；Nicotinamide，10-12mM；FGF7，40-60ng/ml；A83-01，10-15nM；Y-27632，10-15μM；CHIR99021，1-5uM；OncostatinM，10-15ng/ml；Glutamax，1-2X；青霉素链霉素混合液，1-3X；HEPES，0.5-0.8mM，加入至制得的胶中，于37℃、5％CO2浓度下培养7-12天，期间每间隔3-4天更换一次所述培养基。


7.根据权利要求1所述的一种基于肝脏类器官模型的药物肝毒性评价方法，其特征在于：所述将肝脏类器官模型进行药物处理，还包括：将肝脏类器官模型给予0.1％DMSO处理作为空白对照，在不同时间点收集该空白对照的类器官样本，观察形态学变化并检测肝功能指标。


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【专利技术属性】
技术研发人员：李刚，杨志英，陈泽新，
申请(专利权)人：创芯国际生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44