胰岛细胞制备性组合物和使用方法技术

本文公开了可用于制备SC‑细胞的组合物和方法，以及用于各种应用(如细胞疗法)的SC‑细胞的分离群体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】胰岛细胞制备性组合物和使用方法交叉引用本申请要求于2017年11月15日提交的美国临时申请号62/586,808以及于2018年5月9日提交的美国临时申请号62/669,170的权益，这些临时申请各自通过引用整体并入本文。
技术介绍
糖尿病是全球主要的医疗保健问题。根据国际糖尿病联合会(InternationalDiabetesFederation)在2015年的报告，全世界约有超过4亿人患有糖尿病和其并发症。其中，超过五千万人需要注射胰岛素。胰岛中导致胰岛素分泌异常的胰腺β细胞的死亡或功能异常可引起糖尿病。干细胞衍生的β细胞的生成可以为胰岛和胰腺器官的生成提供可能有用的步骤，从而可以为糖尿病提供可能的治疗。可以由干细胞衍生组织治疗的快速生长的疾病之一是糖尿病。I型糖尿病可以由胰岛中β细胞的自身免疫破坏而导致。II型糖尿病可以由外周组织胰岛素抗性和β细胞功能障碍而导致。糖尿病患者，尤其是患有I型糖尿病的患者，可以通过移植新的β细胞而治愈。通过这一举措，可以使移植了尸体的人胰岛的患者在5年或更长时间内不依赖于胰岛素，但是由于供体胰岛的缺乏和质量问题，这种方法是有限的。从干细胞生成无限的人β细胞供应可以将这种疗法扩展到数百万新患者，并且可以成为将干细胞生物学转化到临床中的重要测试案例。
技术实现思路
在一些方面，本文公开了用于生成包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞簇的方法，所述方法包括：使Pdx1阴性、NKX6.1阴性原始肠管细胞的群体与包含骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂和来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的生长因子的组合物接触，从而生成包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞簇，其中所述簇包含至多约30％的CHGA阳性细胞和至多约30％的CDX2阳性细胞，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述PDX1阳性/NKX6.1阴性胰腺祖细胞分化为胰腺β细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述PDX1阳性/NKX6.1阴性胰腺祖细胞分化为PDX1阳性/NKX6.1阳性胰腺祖细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述胰岛素阳性内分泌细胞分化为胰腺β细胞。在一些方面，本文公开了一种方法，其包括：(a)使包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性原始肠管细胞的细胞群体与包含BMP信号传导途径抑制剂和来自TGF-β超家族的生长因子的组合物接触，从而生成包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞簇；以及(b)使包含所述PDX1阳性/NKX6.1阳性胰腺祖细胞的所述细胞簇分化为包含非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述包含非天然胰腺β细胞的细胞簇具有比未与所述BMP信号传导途径抑制剂和所述来自TGF-β超家族的生长因子进行所述接触而生成的可比的细胞簇更高的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)刺激指数。在一些实施方案中，所述细胞簇的所述GSIS刺激指数比所述可比的细胞簇高至少约1.2倍、至少约1.5倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约2.2倍、至少约2.4倍、至少约2.8倍或至少约3倍。在一些实施方案中，所述细胞簇的所述GSIS刺激指数比所述可比的群体高至少约3倍。在一些实施方案中，所述GSIS刺激指数计算为响应于第一葡萄糖浓度的胰岛素分泌与响应于第二葡萄糖浓度的胰岛素分泌之比。在一些实施方案中，所述第一葡萄糖浓度为约10至约50mM，并且所述第二葡萄糖浓度为约1mM至5mM。在一些实施方案中，所述第一葡萄糖浓度为约20mM，并且所述第二葡萄糖浓度为约2.8mM。在一些实施方案中，所述细胞簇包含比所述可比的细胞簇更高百分比的所述非天然胰腺β细胞，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，所述细胞簇包含比所述可比的细胞簇高至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍或至少约1.5倍的所述非天然胰腺β细胞的百分比，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，所述细胞簇包含比所述可比的细胞簇高约1.5倍的所述非天然胰腺β细胞的百分比，如通过流式细胞术所测量的。在一些方面，本文公开了方法，其包括：(a)使包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性原始肠管细胞的细胞群体与包含BMP信号传导途径抑制剂和来自TGF-β超家族的生长因子的组合物接触，从而生成包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞簇；以及(b)使包含所述PDX1阳性/NKX6.1阳性胰腺祖细胞的所述细胞簇分化为包含非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中与未与所述BMP信号传导途径抑制剂和所述来自TGF-β超家族的生长因子进行所述接触而生成的可比的细胞簇相比，所述包含非天然胰腺β细胞的细胞簇包含更高百分比的所述非天然胰腺β细胞，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇包含比所述可比的细胞簇高至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍或至少约1.5倍的所述非天然胰腺β细胞的百分比，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇包含比所述可比的细胞簇高约1.5倍的所述非天然胰腺β细胞的百分比，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，与所述可比的细胞簇相比，包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇响应于葡萄糖负荷表现出更高的胰岛素分泌。在一些实施方案中，与所述可比的细胞簇相比，包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇响应于葡萄糖负荷表现出高至少约1.2、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍的胰岛素分泌。在一些实施方案中，与所述可比的细胞簇相比，包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇表现出更高的GSIS刺激指数。在一些实施方案中，包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇的所述GSIS刺激指数比所述可比的细胞簇高至少约1.2倍、至少约1.5倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约2.2倍、至少约2.4倍、至少约2.8倍或至少约3倍。在一些实施方案中，包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇的所述GSIS刺激指数比所述可比的细胞簇高至少约3倍。在一些实施方案中，所述GSIS刺激指数计算为响应于第一葡萄糖浓度的胰岛素分泌与响应于第二葡萄糖浓度的胰岛素分泌之比。在一些实施方案中，所述第一葡萄糖浓度为约10至约50mM，并且所述第二葡萄糖浓度为约1mM至5mM。在一些实施方案中，所述第一葡萄糖浓度为约20mM，并且所述第二葡萄糖浓度为约2.8mM。在一些实施方案中，所述非天然胰腺β细胞当暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些实施方案中，所述非天然胰腺β细胞响应于K+的第一浓度表现出胰岛素分泌。在一些实施方案中，与所述可比的细胞簇相比，包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇响应于K+的第一浓度表现出更高的胰岛素分泌。在一些实施方案中，与所述可比的细胞簇相比，包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇响应于K+的第一浓度表现出高至少约1.2倍、至少约1.5倍、至少约1.8倍、至少约2倍本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生成包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞簇的方法，所述方法包括：/n使Pdx1阴性、NKX6.1阴性原始肠管细胞的群体与包含骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂和来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的生长因子的组合物接触，从而生成包含所述Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞簇，其中所述簇包含至多约30％的CHGA阳性细胞和至多约30％的CDX2阳性细胞，如通过流式细胞术所测量的。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171115 US 62/586,808;20180509 US 62/669,1701.一种用于生成包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞簇的方法，所述方法包括：
使Pdx1阴性、NKX6.1阴性原始肠管细胞的群体与包含骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂和来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的生长因子的组合物接触，从而生成包含所述Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞簇，其中所述簇包含至多约30％的CHGA阳性细胞和至多约30％的CDX2阳性细胞，如通过流式细胞术所测量的。


2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使所述PDX1阳性/NKX6.1阴性胰腺祖细胞分化为胰腺β细胞。


3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使所述PDX1阳性/NKX6.1阴性胰腺祖细胞分化为PDX1阳性/NKX6.1阳性胰腺祖细胞。


4.根据权利要求3所述的方法，进一步包括使所述NKX6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞。


5.根据权利要求4所述的方法，进一步包括使所述胰岛素阳性内分泌细胞分化为胰腺β细胞。


6.一种方法，包括：
(a)使包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性的原始肠管细胞的细胞群体与包含BMP信号传导途径抑制剂和来自TGF-β超家族的生长因子的组合物接触，从而生成包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞簇，以及
(b)使包含所述PDX1阳性/NKX6.1阳性胰腺祖细胞的所述细胞簇分化为包含非天然胰腺β细胞的细胞簇，
其中所述包含非天然胰腺β细胞的细胞簇具有比未与所述BMP信号传导途径抑制剂和所述来自TGF-β超家族的生长因子进行所述接触而生成的可比的细胞簇更高的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)刺激指数。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞簇的所述GSIS刺激指数比所述可比的细胞簇高至少约1.2倍、至少约1.5倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约2.2倍、至少约2.4倍、至少约2.8倍或至少约3倍。


8.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞簇的所述GSIS刺激指数比所述可比的群体高至少约3倍。


9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述GSIS刺激指数计算为响应于第一葡萄糖浓度的胰岛素分泌与响应于第二葡萄糖浓度的胰岛素分泌之比。


10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一葡萄糖浓度为约10至约50mM，并且所述第二葡萄糖浓度为约1mM至5mM。


11.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一葡萄糖浓度为约20mM，并且所述第二葡萄糖浓度为约2.8mM。


12.根据权利要求6-11中任一项所述的方法，其中所述细胞簇包含比所述可比的细胞簇更高百分比的所述非天然胰腺β细胞，如通过流式细胞术所测量的。


13.根据权利要求6-11中任一项所述的方法，其中所述细胞簇包含比所述可比的细胞簇高至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍或至少约1.5倍的所述非天然胰腺β细胞的百分比，如通过流式细胞术所测量的。


14.根据权利要求6-11中任一项所述的方法，其中所述细胞簇包含比所述可比的细胞簇高约1.5倍的所述非天然胰腺β细胞的百分比，如通过流式细胞术所测量的。


15.一种方法，包括：
(a)使包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性原始肠管细胞的细胞群体与包含BMP信号传导途径抑制剂和来自TGF-β超家族的生长因子的组合物接触，从而生成包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞的细胞簇，以及
(b)使包含所述PDX1阳性/NKX6.1阳性胰腺祖细胞的所述细胞簇分化为包含非天然胰腺β细胞的细胞簇，
其中与未与所述BMP信号传导途径抑制剂和所述来自TGF-β超家族的生长因子进行所述接触而生成的可比的细胞簇相比，所述包含非天然胰腺β细胞的细胞簇包含更高百分比的所述非天然胰腺β细胞，如通过流式细胞术所测量的。


16.根据权利要求15所述的方法，其中包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇包含比所述可比的细胞簇高至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍或至少约1.5倍的所述非天然胰腺β细胞的百分比，如通过流式细胞术所测量的。


17.根据权利要求15或16所述的方法，其中包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇包含比所述可比的细胞簇高约1.5倍的所述非天然胰腺β细胞的百分比，如通过流式细胞术所测量的。


18.根据权利要求6-17中任一项所述的方法，其中与所述可比的细胞簇相比，包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇响应于葡萄糖负荷表现出更高的胰岛素分泌。


19.根据权利要求6-17中任一项所述的方法，其中与所述可比的细胞簇相比，包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇响应于葡萄糖负荷表现出高至少约1.2、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍的胰岛素分泌。


20.根据权利要求6-19中任一项所述的方法，其中与所述可比的细胞簇相比，包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇表现出更高的GSIS刺激指数。


21.根据权利要求6-19中任一项所述的方法，其中包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇的所述GSIS刺激指数比所述可比的细胞簇高至少约1.2倍、至少约1.5倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约2.2倍、至少约2.4倍、至少约2.8倍或至少约3倍。


22.根据权利要求6-21中任一项所述的方法，其中包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇的所述GSIS刺激指数比所述可比的细胞簇高至少约3倍。


23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述GSIS刺激指数计算为响应于第一葡萄糖浓度的胰岛素分泌与响应于第二葡萄糖浓度的胰岛素分泌之比。


24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一葡萄糖浓度为约10至约50mM，并且所述第二葡萄糖浓度为约1mM至5mM。


25.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一葡萄糖浓度为约20mM，并且所述第二葡萄糖浓度为约2.8mM。


26.根据权利要求6-25中任一项所述的方法，其中所述非天然胰腺β细胞当暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。


27.根据权利要求6-26中任一项所述的方法，其中所述非天然胰腺β细胞响应于K+的第一浓度表现出胰岛素分泌。


28.根据权利要求6-27中任一项所述的方法，其中与所述可比的细胞簇相比，包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇响应于K+的第一浓度表现出更高的胰岛素分泌。


29.根据权利要求6-27中任一项所述的方法，其中与所述可比的细胞簇相比，包含所述非天然胰腺β细胞的所述细胞簇响应于K+的第一浓度表现出高至少约1.2倍、至少约1.5倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约2.2倍、至少约2.4倍、至少约2.8倍、至少约3倍、至少约3.2倍、至少约3.4倍、至少约3.6倍、至少约3.8倍、至少约4倍的胰岛素分泌。


30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述BMP信号传导途径的抑制剂包括DMH-1、其衍生物、类似物或变体。


31.根据权利要求30所述的方法，其中所述组合物包含约0.01μM至约10μM、约0.05μM至约5μM、约0.1μM至约1μM或约0.15μM至约0.5μM的DMH-1。


32.根据权利要求30所述的方法，其中所述组合物包含约0.25μM的DMH-1。


33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述来自TGF-β超家族的生长因子包括激活素A。


34.根据权利要求33所述的方法，其中所述组合物包含约0.5ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约2ng/mL至约50ng/mL或约5ng/mL至约30ng/mL的激活素A。


35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述组合物包含至少约5ng/mL或至少约10ng/mL的激活素A。


36.根据权利要求33所述的方法，其中所述组合物包含约20ng/mL的激活素A。


37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包含选自下组的分化因子：来自FGF家族的生长因子、SHH途径抑制剂、RA信号传导途径激活剂、蛋白激酶C激活剂和ROCK抑制剂。


38.一种方法，其包括在包含约0.01％(w/v)至约0.5％(w/v)的人血清白蛋白(HSA)的培养基中使包含Pdx1阴性、NKX6.1阴性原始肠管细胞的细胞群体分化，从而生成包含Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的细胞簇。


39.根据权利要求38所述的方法，其中包含所述Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的所述细胞簇中至少约60％、至少约70％或至少约85％的细胞是Pdx1阳性的，如通过流式细胞术所测量的。


40.根据权利要求38或39所述的方法，其中包含所述Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的所述细胞簇中至少约85％的细胞是Pdx1阳性的，如通过流式细胞术所测量的。


41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中包含所述Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的所述细胞簇中至多约40％、至多约30％、至多约20％或至多约15％的细胞是CDX2阳性细胞，如通过流式细胞术所测量的。


42.根据权利要求38-41中任一项所述的方法，其中包含所述Pdx1阳性、NKX6.1阴性胰腺祖细胞的所述细胞簇中至多约15％的细胞是CDX2阳性细胞，如通过流式细胞术所测量的。


43.根据权利要求38-42中任一项所述的方法，其中所述培养基进一步包含选自下组的分化因子：BMP信号传导途径抑制剂、来自TGF-β超家族的生长因子、来自FGF家族的生长因子、SHH途径抑制剂、RA信号传导途径激活剂、蛋白激酶C激活剂和ROCK抑制剂。


44.根据权利要求38-42中任一项所述的方法，其中所述培养基进一步包含BMP信号传导途径抑制剂和来自TGF-β超家族的生长因子。


45.一种方法，包括：
(a)在包含骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂、来自转化生长因子β(TGF-β)超家族的生长因子和人血清白蛋白(HSA)的培养基中培养包含原始肠管细胞的细胞群体，从而生成包含Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺组细胞的细胞簇；以及
(b)使包含所述PDX1阳性/NKX6.1阳性胰腺祖细胞的所述细胞簇分化为包含非天然胰腺β细胞的细胞簇。


46.一种细胞簇，包含至少约50％的Pdx1阳性、NKX6.1阳性胰腺祖细胞、至多约30％的嗜铬粒蛋白A(CHGA)阳性细胞和至多约30％的CDX2阳性细胞，如通过流式细胞术所测量的。


47.根据权利要求46所述的细胞簇，包含至多约25％的所述CDX2阳性、NKX6.1阳性细胞，如通过流式细胞术所测量的。


48.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：奥斯汀·蒂尔，吉哈德·亚辛，埃夫雷特·汤普森，费利西亚·J·帕柳卡，
申请(专利权)人：森玛治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US