【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】干细胞衍生的胰腺β细胞的重聚交叉引用本申请要求于2017年7月21日提交的美国临时申请号62/535,659的权益，该申请通过引用整体并入本文。
技术介绍
胰腺或胰岛移植已被用于治疗糖尿病，如I型糖尿病。胰岛移植不需要进行大手术，并且胰岛移植物的功能可以在接受者体内维持数年。然而，胰岛供体的缺乏阻碍了这种疗法的有效实施。人造胰腺或胰岛提供了可移植胰岛的替代来源。因此，需要功能和特征类似于内源性胰岛的胰岛体外重建方法。
技术实现思路
在一方面，本公开内容提供了体外细胞簇，其包含至少一种非天然胰腺β细胞，其在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答，其中所述细胞簇是未分选的细胞簇，并且其中所述细胞簇包含：(a)至少约35％的表达NKX6.1和C肽的细胞；(b)至少约70％的表达嗜铬粒蛋白A的细胞；(c)至多约2％的表达SOX2的细胞；或者(d)至多约10％的表达SOX9的细胞。在另一方面，本公开内容提供了体外细胞簇，其包含至少一种不包含荧光蛋白的NKX6.1+和C肽+细胞，其中所述细胞簇在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答，并且其中所述细胞簇包含：(a)至少约35％的表达NKX6.1和C肽的细胞；(b)至少约70％的表达嗜铬粒蛋白A的细胞；(c)至多约2％的表达SOX2的细胞；或者(d)至多约10％的表达SOX9的细胞。在一些情况下，至少一种NKX6.1+和C肽+细胞是非天然胰腺β细胞，其在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些情况下，细胞簇...
【技术保护点】
1.一种体外细胞簇，其包含至少一种非天然胰腺β细胞，所述非天然胰腺β细胞在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答，其中所述细胞簇是未分选的细胞簇，并且其中所述细胞簇包含：/n(a)至少约35％的表达NKX6.1和C肽的细胞；/n(b)至少约70％的表达嗜铬粒蛋白A的细胞；/n(c)至多约2％的表达SOX2的细胞；或者/n(d)至多约10％的表达SOX9的细胞。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170721 US 62/535,6591.一种体外细胞簇，其包含至少一种非天然胰腺β细胞，所述非天然胰腺β细胞在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答，其中所述细胞簇是未分选的细胞簇，并且其中所述细胞簇包含：
(a)至少约35％的表达NKX6.1和C肽的细胞；
(b)至少约70％的表达嗜铬粒蛋白A的细胞；
(c)至多约2％的表达SOX2的细胞；或者
(d)至多约10％的表达SOX9的细胞。
2.一种体外细胞簇，其包含至少一种不包含荧光蛋白的NKX6.1+和C肽+细胞，其中所述细胞簇在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答，并且其中所述细胞簇包含：
(a)至少约35％的表达NKX6.1和C肽的细胞；
(b)至少约70％的表达嗜铬粒蛋白A的细胞；
(c)至多约2％的表达SOX2的细胞；或者
(d)至多约10％的表达SOX9的细胞。
3.根据权利要求1所述的细胞簇，其中所述至少一种NKX6.1+和C肽+细胞是非天然胰腺β细胞，其在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的细胞簇，其包含至少约35％的表达NKX6.1和C肽的细胞。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的细胞簇，其包含至少约40％或至少约60％的表达NKX6.1和C肽的细胞。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的细胞簇，其包含至少约70％的表达嗜铬粒蛋白A的细胞。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的细胞簇，其包含至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％的表达嗜铬粒蛋白A的细胞。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的细胞簇，其包含至多约2％的表达SOX2的所述细胞簇中的细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的细胞簇，其包含至多约1.5％、至多约1％或至多约0.5％的表达SOX2的细胞。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的细胞簇，其包含至多约10％的表达SOX9的细胞。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的细胞簇，其包含至多约5％、至多约3％或至多约2％的表达SOX9的细胞。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的细胞簇，其包含至多约2％、至多约1％、至多约0.5％或至多约0.1％的表达Ki67的细胞。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的细胞簇，其中所述体外细胞簇具有约150μm的直径。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的细胞簇，其中所述体外细胞簇具有约50μm至约250μm的直径。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的细胞簇，其中所述体外细胞簇具有约100μm至约200μm的直径。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的细胞簇，其中与第二葡萄糖浓度相比，所述体外细胞簇响应于第一葡萄糖浓度表现出更高的胰岛素分泌，其中所述第一葡萄糖浓度高于所述第二葡萄糖浓度。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的细胞簇，其中所述体外细胞簇进一步包含至少一种表达胰高血糖素的细胞或至少一种表达促生长素抑制素的细胞。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的细胞簇，其中所述体外细胞簇响应于K+的第一浓度表现出胰岛素分泌。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的细胞簇，其中当移植到受试者体内时，所述体外细胞簇在移植后28天内对所述受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的细胞簇，其中当移植到受试者体内时，所述第二体外细胞簇在移植后14天内对所述受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
21.根据权利要求1或3-20中任一项所述的细胞簇，其中：
(a)所述至少一种非天然胰腺β细胞包含一个或多个晶体胰岛素颗粒；
(b)所述至少一种非天然胰腺β细胞表达以下基因：INS、PDX1、NKX6-1和ZNT8；或者
(c)所述至少一种非天然胰腺β细胞不表达促生长素抑制素和胰高血糖素中的至少一种。
22.根据权利要求1或3-21中任一项所述的细胞簇，其中当顺序地施加第一葡萄糖负荷、第二葡萄糖负荷和第三葡萄糖负荷时，所述至少一种非天然胰腺β细胞对所述第一葡萄糖负荷、所述第二葡萄糖负荷和所述第三葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
23.根据权利要求1或3-22中任一项所述的细胞簇，其中所述至少一种非天然胰腺β细胞响应于葡萄糖负荷的胰岛素分泌与所述葡萄糖负荷的葡萄糖浓度成比例。
24.根据权利要求1或3-23中任一项所述的细胞簇，其中所述至少一种非天然胰腺β细胞是基因修饰的。
25.根据权利要求1或3-24中任一项所述的细胞簇，其中所述至少一种非天然胰腺β细胞不包含编码信号多肽的外源性核酸序列，所述信号多肽指示所述至少一种非天然胰腺β细胞中的胰岛素表达。
26.根据权利要求25所述的细胞簇，其中所述非天然胰腺β细胞中所述信号多肽的表达由胰岛素启动子所驱动。
27.根据权利要求25所述的细胞簇，其中所述信号多肽包括荧光蛋白。
28.一种组合物，其包含在培养基中的根据权利要求1-27中任一项所述的至少一种细胞簇。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述培养基是无血清的。
30.根据权利要求28或29所述的组合物，其中重聚培养基不包含三碘甲腺原氨酸。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的组合物，其中所述重聚培养基不包含外源性甲状腺激素信号传导途径激活剂。
32.根据权利要求28-31中任一项所述的组合物，其中所述重聚培养基不包含激活受体样激酶-5(Alk5)抑制剂。
33.根据权利要求28-32中任一项所述的组合物，其中所述培养基不包含Rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)的外源性抑制剂。
34.根据权利要求28-33中任一项所述的组合物，其中所述培养基不包含外源性细胞外基质分子。
35.根据权利要求28-34中任一项所述的组合物，其中所述细胞簇悬浮在所述培养基中。
36.根据权利要求28-35中任一项所述的组合物，其中所述培养基以至少30rpm的预定速度进行搅拌。
37.根据权利要求28-36中任一项所述的组合物，其中所述培养基以至少60rpm的预定速度进行搅拌。
38.根据权利要求28-37中任一项所述的组合物，其中所述培养基包括MCDB131基础培养基。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述MCDB131基础培养基补充有2％的牛血清白蛋白(BSA)。
40.根据权利要求28-39中任一项所述的组合物，其中所述培养基包括CMRLs培养基。
41.根据权利要求28-40中任一项所述的组合物，进一步包含含有所述至少一种细胞簇和所述培养基的生物反应器。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述生物反应器包括转瓶。
43.一种方法，其包括：
(a)在培养基中使包含至少一种NKX6.1+细胞的细胞群体分化为包含至少一种NKX6.1+和C肽+细胞的第一细胞簇，所述培养基包含选自以下的因子：转化生长因子β(TGF-β)信号传导途径抑制剂、甲状腺激素(TH)信号传导途径激活剂、至少一种音猬(SHH)途径抑制剂、视黄酸(RA)信号传导途径激活剂、γ-分泌酶抑制剂、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径抑制剂、至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子及其任何组合；
(b)从所述第一细胞簇解离多个细胞；以及
(c)在重聚培养基中培养来自(b)的所述多个细胞，并允许所述多个细胞的至少部分形成第二体外细胞簇，
其中：
(i)至少约35％的细胞表达NKX6.1和C肽；
(ii)至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白A；
(iii)至多约2％的细胞表达SOX2；或
(iv)至多约10％的细胞表达SOX9。
44.一种方法，其包括：
(a)获得包含至少一种NKX6.1+和C肽+细胞的第一细胞簇；
(b)从所述第一细胞簇解离多个细胞；以及
(c)在重聚培养基中培养来自(b)的所述多个细胞，并允许所述多个细胞的至少部分形成第二体外细胞簇，
其中：
(i)至少约35％的细胞表达NKX6.1和C肽；
(ii)至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白A；
(iii)至多约2％的细胞表达SOX2；或
(iv)至多约10％的细胞表达SOX9。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述至少一种来自表皮生长因子(EGF)家族的生长因子包括β细胞素。
46.一种方法，其包括：
(a)获得包含至少一种NKX6.1+和C肽+细胞的第一细胞簇；
(b)从所述第一细胞簇解离多个细胞，其中所述解离不包括使所述多个细胞经历流式细胞术；以及
(c)在无血清重聚培养基中培养来自(b)的所述多个细胞，并允许所述多个细胞的至少部分形成第二体外细胞簇，
其中：
(i)与所述第一细胞簇相比，所述第二体外细胞簇包含更高百分比的表达嗜铬粒蛋白A的细胞；
(ii)与所述第一细胞簇相比，所述第二体外细胞簇包含更高百分比的表达NKX6.1和C肽的细胞；
(iii)与所述第一细胞簇相比，所述第二体外细胞簇包含更低百分比的表达SOX2的细胞；或
(iv)与所述第一细胞簇相比，所述第二体外细胞簇包含更低百分比的表达SOX9的细胞。
47.一种方法，其包括：
(a)获得包含至少一种NKX6.1+和C肽+细胞的第一细胞簇；
(b)从所述第一细胞簇解离多个细胞，其中所述解离不包括使所述多个细胞经历流式细胞术；以及
(c)在重聚培养基中培养来自(b)的所述多个细胞，并允许所述多个细胞的至少部分形成第二体外细胞簇，
其中所述第二体外细胞簇包含至少一种非天然胰腺β细胞，其在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答；并且
其中：
(i)至少约35％的细胞表达NKX6.1和C肽；
(ii)至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白A；
(iii)至多约2％的细胞表达SOX2；或
(iv)至多约10％的细胞表达SOX9。
48.根据权利要求43-46中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇包含至少一种非天然胰腺β细胞，其在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
49.根据权利要求43-48中任一项所述的方法，其中所述解离包括所述第一细胞簇的酶促解离。
50.根据权利要求43-49中任一项所述的方法，其中所述解离包括使所述第一细胞簇与胰蛋白酶接触。
51.根据权利要求43-45或47-50中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基是无血清的。
52.根据权利要求43-51中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基以预定速度搅拌。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述预定速度是至少30rpm或至少60rpm。
54.根据权利要求43-53中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基包括MCDB131基础培养基。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述MCDB131基础培养基补充有2％的牛血清白蛋白(BSA)。
56.根据权利要求43-53中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基包括CMRLs培养基。
57.根据权利要求43-56中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基包括MCDB131基础培养基。
58.根据权利要求47-57中任一项所述的方法，其中：
(a)所述至少一种非天然胰腺β细胞包含一个或多个晶体胰岛素颗粒；
(b)所述至少一种非天然胰腺β细胞表达以下基因：INS、PDX1、NKX6-1和ZNT8；或者
(c)所述至少一种非天然胰腺β细胞不表达促生长素抑制素和胰高血糖素中的至少一种。
59.根据权利要求47-58中任一项所述的方法，其中当顺序地施加第一葡萄糖负荷、第二葡萄糖负荷和第三葡萄糖负荷时，所述至少一种非天然胰腺β细胞对所述第一葡萄糖负荷、所述第二葡萄糖负荷和所述第三葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
60.根据权利要求47-59中任一项所述的方法，其中所述至少一种非天然胰腺β细胞是基因修饰的。
61.根据权利要求47-60中任一项所述的方法，其中所述至少一种非天然胰腺β细胞响应于葡萄糖负荷的胰岛素分泌与所述葡萄糖负荷的葡萄糖浓度成比例。
62.根据权利要求43-61中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基不包含三碘甲腺原氨酸。
63.根据权利要求43-62中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基不包含外源性甲状腺激素信号传导途径激活剂。
64.根据权利要求43-63中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基不包含激活受体样激酶-5(Alk5)抑制剂。
65.根据权利要求43-64中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基不包含外源性转化生长因子β信号传导途径抑制剂。
66.根据权利要求43-65中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基不包含Rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)的外源性抑制剂。
67.根据权利要求43-66中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基不包含外源性细胞外基质分子。
68.根据权利要求43-67中任一项所述的方法，其中所述第一细胞簇是从冷冻保存恢复的。
69.根据权利要求43-68中任一项所述的方法，进一步包括从冷冻保存恢复所述第一细胞簇。
70.根据权利要求43-69中任一项所述的方法，进一步包括在所述培养前将所述多个细胞冷冻保存一段时间。
71.根据权利要求70所述的方法，进一步包括在所述培养前从所述冷冻保存恢复所述多个细胞。
72.根据权利要求43-71中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇具有所述第一细胞簇的至多50％的直径。
73.根据权利要求43-72中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇具有所述第一细胞簇的至多30％的直径。
74.根据权利要求43-73中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇具有约150μm的直径。
75.根据权利要求43-73中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇具有约50μm至约250μm的直径。
76.根据权利要求43-75中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇具有约100μm至约200μm的直径。
77.根据权利要求43-76中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇中表达嗜铬粒蛋白A的细胞的百分比比所述第一细胞簇中表达嗜铬粒蛋白A的细胞的百分比高至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍或至少1.5倍。
78.根据权利要求43-77中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇包含至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％的表达嗜铬粒蛋白A的细胞。
79.根据权利要求43-78中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇中表达NKX6.1和C肽的细胞的百分比比所述第一细胞簇中表达NKX6.1和C肽的细胞的百分比高至少1.5倍、至少1.75倍或至少2倍。
80.根据权利要求43-79中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇包含至少约35％、至少约40％或至少约60％的表达NKX6.1和C肽的细胞。
81.根据权利要求43-80中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇中表达SOX2的细胞的百分比比所述第一细胞簇中表达SOX2的细胞的百分比低至少2倍、至少3倍、至少5倍或至少10倍。
82.根据权利要求43-81中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇包含至多约2％、至多约1.5％、至多约1％或至多约0.5％的表达SOX2的细胞。
83.根据权利要求43-82中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇中表达SOX9的细胞的百分比比所述第一细胞簇中表达SOX9的细胞的百分比低至少2倍、至少3倍、至少5倍或至少10倍。
84.根据权利要求43-83中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇包含至多约10％、至多约5％、至多约3％或至多约2％的表达SOX9的细胞。
85.根据权利要求43-84中任一项所述的方法，其中与所述第一细胞簇相比，所述第二体外细胞簇具有较低百分比的表达Ki67的细胞。
86.根据权利要求43-85中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇包含至多约2％、至多约1％、至多约0.5％或至多约0.1％的表达Ki67的细胞。
87.根据权利要求43-86中任一项所述的方法，其中与所述第一细胞簇相比，所述第二体外细胞簇具有更高的胰岛素含量。
88.根据权利要求43-87中任一项所述的方法，其中与所述第一细胞簇相比，所述第二体外细胞簇具有高至少1.1倍、至少1.25倍或至少1.5倍的胰岛素含量。
89.根据权利要求43-88中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇与所述第一细胞簇相比表现出更高的刺激指数，其中所述刺激指数等于响应于第一葡萄糖浓度与第...
【专利技术属性】
技术研发人员：柏叶军，乔治·哈尔卜，费利西亚·J·帕柳卡，
申请(专利权)人：森玛治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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