干细胞体外扩增方法技术

本发明专利技术提供一种干细胞体外扩增方法，所述方法包括：A、将2D环境下培养的干细胞团块消化成单细胞，与水凝胶溶液混合，得到单细胞‑水凝胶悬液；B、采用生物打印技术将所述单细胞‑水凝胶悬液打印成含有干细胞的微结构体；C、采用干细胞培养液培养所述微结构体，使干细胞在微结构体提供的三维环境中稳定扩增。本发明专利技术提供的干细胞扩增方法，工艺简单、温和，不仅能够为干细胞增殖提供稳定的3D微环境，还增加了细胞扩增空间，减少外界刺激对干细胞的不良影响，在保证细胞大量扩增的同时，维持多能干细胞全能性/其他干细胞干性。本发明专利技术为干细胞在组织工程、再生医学或药物研究等方面，提供大量种子细胞。

【技术实现步骤摘要】
干细胞体外扩增方法
本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种干细胞体外扩增方法。
技术介绍
干细胞是一类具有增殖和分化潜能的细胞，能够分化成各种组织器官的特异性细胞类型。按照分化潜能的大小，干细胞可以分为全能干细胞(TotipotentStemCell)、多能干细胞(PluripotentStemCell)、专能干细胞(MultipotentStemCell)和单能干细胞(UnipotentStemCell)。其中，多能干细胞(PluripotentStemCell)可以分化成为来源于三胚层的所有细胞，形成所有组织和器官，用于多种组织器官修复、疾病治疗和药物筛查，因而成为干细胞研究的热点。胚胎干细胞(EmbryonicStemCell，ESC)和诱导多能干细胞(InducedPluripotentStemCell，iPSC)是目前研究较多的多能干细胞。然而，由于生命伦理道德问题和免疫排斥问题，ESC的研究颇受争议。iPSC则避免了ESC的伦理道德问题，iPSC可通过对体细胞进行基因重编程获得，来源广泛，并且解决了干细胞移植的免疫排斥问题，成为干细胞研究领域的一项重大突破。尽管iPSC来源广泛，但是它对各种外界因素的扰动较为敏感，包括力学刺激、温度变化、光照等，这些因素的改变很可能导致iPSC的凋亡、分化，降低细胞存活率和全能性。因此，合适、稳定的微环境对iPSC的培养和应用至关重要。目前iPSC(同ESC的培养)多采用2D方法在包被Matrigel(基质胶)或Vitronectin(玻连蛋白)的多孔板上进行贴壁培养，随着时间增加，孔板底面出现大而致密的克隆，当细胞克隆过大或者细胞汇合度达到85％时即需要进行传代。采用2D培养方法无法模拟干细胞在体内的活动，由于空间限制需要多次传代，增加对细胞的不利因素，影响细胞状态，导致细胞的大量分化或凋亡。为了更好地模拟体内稳定的3D微环境进行干细胞扩增，减少对细胞不利操作的次数，维持干细胞分化能力，亟待开发新的干细胞扩增方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种干细胞体外扩增方法，其是一种基于3D打印的干细胞扩增方法。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种干细胞体外扩增方法，包括以下步骤：A、将2D环境下培养的干细胞团块消化成单细胞，与水凝胶溶液混合，得到单细胞-水凝胶悬液；B、采用生物打印技术将所述单细胞-水凝胶悬液打印成含有干细胞的微结构体；C、采用干细胞培养液培养所述微结构体，使干细胞在微结构体提供的三维环境中稳定扩增。步骤A包括以下子步骤：A1、干细胞的2D培养：将干细胞在包被有基质胶和/或玻连蛋白微孔板中进行贴壁培养，当细胞达到80％-90％汇合度时按照1:5-20的比例传代3-8次(若汇合度未达到80％，干细胞克隆团较大也需要传代，传代比例根据实际细胞数量确定)，每18-24小时更换一次培养基，培养4-7天，用于后续消化；A2、单细胞-水凝胶悬液的制备：消化前，向A1所得培养物中加入Rock抑制剂，然后加入细胞消化液将干细胞团块消化成单细胞，离心收集单细胞沉淀，用培养基重悬细胞，然后与水凝胶溶液混合，并加入适量基质胶和/或玻连蛋白，混匀，得到单细胞-水凝胶悬液。步骤B包括：将所述单细胞-水凝胶悬液装载到生物打印设备，打印至装有交联剂的容器中，得到结构稳定含有干细胞的微结构体。步骤C包括：将所述微结构体转移至离心管中，微结构体沉降至离心管底部，将上层清液吸走，用培养基清洗后，将将所述微结构体接入微孔板中培养，并向培养基中加入Rock抑制剂，培养18-24小时后去除Rock抑制剂，每天更换一次培养基，使干细胞在微结构体提供的三维环境中稳定扩增。所述干细胞为多能干细胞或专能干细胞，优选诱导多能干细胞(iPSC)。本专利技术还适用于除了多能干细胞以外的其他干细胞，例如，来自哺乳动物和灵长类动物的胚胎干细胞(ESC)。所述专能干细胞如造血干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、成骨干细胞、软骨干细胞、肌肉干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞、内皮干细胞、角膜干细胞、毛囊干细胞、胃肠干细胞、乳腺干细胞、心脏干细胞等。本专利技术中，水凝胶选用天然和/或人工合成的具有生物兼容性的水凝胶材料。天然水凝胶材料选自明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、氨基酸、氨基酸衍生物、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白及衍生材料、透明质酸、透明质酸衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白衍生物、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、玻连蛋白、骨桥蛋白、肽段水凝胶、DNA水凝胶等中的至少一种，优选海藻酸钠、明胶、基质胶或胶原。人工合成的水凝胶材料选自聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯等中的至少一种，优选聚乳酸或乳酸-羟基乙酸共聚物。本专利技术所述生物打印技术采用喷墨生物打印技术，所述喷墨生物打印技术是基于热气泡法、压电式、阀基式或高压静电法的3D打印技术。本专利技术使用的细胞消化液包含蛋白水解酶和胶原酶。例如，可以使用商品化试剂ReLeSRTM(StemcellTechnologies,05872)，细胞消化液(LifeTechnologies，A11105-01)等。优选地，所述交联剂为可溶性钙盐溶液，如CaCl2溶液。优选地，所述Rock抑制剂为Y-27632。前述的方法，细胞培养条件为：35℃～38℃(优选37℃)，5％CO2。第二方面，本专利技术提供iPSC体外扩增方法，包括以下步骤：1)iPSC的2D培养将iPSC在包被有基质胶和/或玻连蛋白微孔板中进行贴壁培养，当细胞达到85％汇合度时按照1:10的比例进行传代3次(若汇合度未达到85％，iPSC克隆团较大也需要传代，传代比例根据实际细胞数量确定)，每18-24小时更换一次完全培养基，培养时间6天，可用于后续消化；2)单细胞-水凝胶悬液的制备iPSC消化成单细胞前，加入Rock抑制剂(Y-27632)至完全培养基孵育0.5-2小时，培养基中Rock抑制剂的终浓度为5-20uM，然后加入细胞消化液将iPSC细胞团块消化成单细胞，离心收集单细胞沉淀，用基础培养基重悬细胞，然后与水凝胶溶液混合，并加入适量基质胶和/或玻连蛋白，混匀，得到单细胞-水凝胶悬液；3)采用喷墨生物打印技术获得含有iPSC的微结构体将单细胞-水凝胶悬液装载到喷墨生物打印设备，打印至装有100-400mMCaCl2溶液(优选100mMCaCl2溶液)的容器中，得到结构稳定含有iPSC的微结构体；4)含有iPSC的微结构体的收集将含有iPSC的微本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.干细胞体外扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：/nA、将2D环境下培养的干细胞团块消化成单细胞，与水凝胶溶液混合，得到单细胞-水凝胶悬液；/nB、采用生物打印技术将所述单细胞-水凝胶悬液打印成含有干细胞的微结构体；/nC、采用干细胞培养液培养所述微结构体，使干细胞在微结构体提供的三维环境中稳定扩增。/n

【技术特征摘要】
1.干细胞体外扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将2D环境下培养的干细胞团块消化成单细胞，与水凝胶溶液混合，得到单细胞-水凝胶悬液；
B、采用生物打印技术将所述单细胞-水凝胶悬液打印成含有干细胞的微结构体；
C、采用干细胞培养液培养所述微结构体，使干细胞在微结构体提供的三维环境中稳定扩增。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A包括以下子步骤：
A1、干细胞的2D培养：将干细胞在包被有基质胶和/或玻连蛋白微孔板中进行贴壁培养，当细胞达到80％-90％汇合度时按照1:5-20的比例传代3-8次，每18-24小时更换一次培养基，培养4-7天，用于后续消化；
A2、单细胞-水凝胶悬液的制备：消化前，向A1所得培养物中加入Rock抑制剂，然后加入细胞消化液将干细胞团块消化成单细胞，离心收集单细胞沉淀，用培养基重悬细胞，然后与水凝胶溶液混合，并加入适量基质胶和/或玻连蛋白，混匀，得到单细胞-水凝胶悬液。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B包括：将所述单细胞-水凝胶悬液装载到生物打印设备，打印至装有交联剂的容器中，得到结构稳定含有干细胞的微结构体。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C包括：将所述微结构体转移至离心管中，微结构体沉降至离心管底部，将上层清液吸走，用培养基清洗后，将将所述微结构体接入微孔板中培养，并向培养基中加入Rock抑制剂，培养18-24小时后去除Rock抑制剂，每天更换一次培养基，使干细胞在微结构体提供的三维环境中稳定扩增。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞为多能干细胞或专能干细胞，优选诱导多能干细胞。


6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，水凝胶选用天然和/或人工合成的具有生物兼容性的水凝胶材料；
天然水凝胶材料选自明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、氨基酸、氨基酸衍生物、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白及衍生材料、透明质酸、透明质酸衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白衍生物、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、玻连蛋白、骨桥蛋白、肽段水凝胶、DNA水凝胶中的至少一种，优选海藻酸钠、明胶、基质胶或胶原；
人工合成的水凝胶材料选自聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚睿，徐铭恩，
申请(专利权)人：杭州捷诺飞生物科技股份有限公司，清华大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33