与多能细胞有关的方法技术

本文所描述的技术涉及与例如在不引入外源遗传物质的情况下引起细胞呈现更多能状态有关的方法、测定和组合物。

【技术实现步骤摘要】
与多能细胞有关的方法本申请是申请号为201580026499.6(PCT申请号为PCT/US2015/021418)、申请日为2015年03月19日、专利技术名称为“与多能细胞有关的方法”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2014年3月19日提交的美国临时申请号61/955,362、于2014年3月19日提交的美国临时申请号61/955,358和于2014年8月28日提交的美国临时申请号62/043,042的权益，这些申请的全部内容通过引用被并入本文中。
本文所描述的技术涉及多能细胞的生产。
技术介绍
获得多能细胞的现行方法主要取决于可获得途径有限的组织(例如胚胎组织或脐带血)或涉及外源性核酸引入的重编程因子的加入(Hanna,J.等人，Cell2008133,250-264；Hockemeyer,D.等人，Cellstemcell20083,346-353；Kim,D.等人，Cellstemcell20094,472-476；Kim,J.B.Nature2009461,649-643；Okabe,M.等人，Blood2009114,1764-1767)。容易生产干细胞(特别是自体干细胞)而不会有由外源性重编程因子的加入所引入的并发症的方法加速了对细胞分化的研究和基于干细胞的疗法的发展。虽然推测由于暴露于刺激(诸如烧伤、化学损伤、创伤和辐射)对细胞的损害可能改变正常体细胞而变成癌细胞，但还不存在健康成年体细胞可被转变为其他状态，而无需对重编程因子的特异性操控的直接证据。之前，研究员已经报道了在成体组织中发现“成体干细胞”(Reynolds,B.A.&Weiss,S.Science1992255,1707-1710；Megeney,L.A.等人，Genes&development199610,1173-1183；Caplan,A.I.Journaloforthopaedicresearch19919,641-650；Lavker,R.M.&Sun,T.T.TheJournalofinvestigativedermatology198381,121s-127s)。这些报告仍然存在争议。例如，正在寻找表达干细胞标志物Oct4的细胞的研究员未能在正常体内平衡的成体骨髓中发现Oct4表达细胞(Lengner,C.J.等人，CellCycle20087,725-728；Berg,J.S.&Goodell,M.A.Cellstemcell20071,359-360)，而其他研究员报道了从不同的成体组织分离Oct4表达细胞的能力(Jiang,Y.等人，Nature2010418,41-49；D'Ippolito,G.等人，Journalofcellscience2004117,2971-2981；Johnson,J.等人，Cell2005122,303-315；Kucia,M.等人，Leukemia200620,857-869；Kuroda,Y.等人，PNAS2011107,8639-8643；Obokata,H.等人，Tissueengineering.2011PartA17,607-615；Rahnemai-Azar,A.等人，Cytotherapy201113,179-192；Huang,Y.等人，Transplantation201089,677-685；Zuba-Surma,E.K.等人，Journalofcellularandmolecularmedicine201115,1319-1328；Paczkowska,E.等人，Annalsoftransplantation201116,59-71)。已推测这些细胞代表成体干细胞群，或者仅是所使用技术的人工制品。在任何一种情况下，它们仍然是罕见的，并且不代表用于研究和治疗目的多能细胞的足够来源。
技术实现思路
本文描述了用于生成多能细胞(例如STAP细胞)的改进方法，与各自通过引入并入本文中的国际专利公开WO2013/163296和Obokata等人的Nature(自然)2014505:641-647中所描述的方法相比，该改进方法提供了提高的效率、产量和/或质量。本文中还描述了与通过本方法生成的细胞有关的方法和用途。附图说明图1A-1D描绘了从CD45阳性体细胞生成的Oct4表达细胞。图1A描绘了应激(应力，stress)处理的细胞的Oct4-GFP表达。应激处理的细胞表达Oct4-GFP，而未处理的对照没有表达Oct4-GFP。在应激处理组中的右上方示出了Oct4表达集落的放大图。比例尺指示了100μm。图1B描绘了应激处理的细胞和未应激处理的对照的群分析。在第5天，仅在应激处理组中观察到了GFP表达细胞群。图1C描绘了在第7天，在应激处理之前和之后的CD45阳性细胞的细胞尺寸分析。图1D描绘了应激处理之后CD45阳性细胞随时间顺序的变化。图2A-2B描绘了动物愈伤组织(callus)细胞(ACC)的特征。图2A描绘了多能标志物基因随时间顺序的基因表达变化。信使RNA水平被归一化为GAPDH(n＝3，平均值+S.D.)。图2B描绘了Oct4和Nanog启动子基因的甲基化分析。图3A-3D描绘了应激处理之后的细胞修饰。图3A描绘了在ACC生成阶段期间的应激防御基因的相关基因表达。在第3天和第7天收集样品，并与CD45阳性细胞进行比较(n＝3，平均值+S.D.)。图3B描绘了总细胞ATP测量(n＝3，平均值+S.D.)。图3C描绘了ROS测量。误差棒指示了SD。图3D描绘了mtDNA复制因子的相关基因表达(n＝3，平均值+S.D.)。图4A-4B描绘了自ACC的嵌合体小鼠生成。图4A描绘了嵌合体小鼠生成的图示。组图(panel)(i)表明了用胰蛋白酶将AC解离成单细胞或(组图ii)将AC切成小块然后注入胚泡。图4B描绘了嵌合体贡献分析(contributionanalysis)。通过FACS分析来自9只小狗的组织。图5A-5C在ACC生成条件下实验。图5A表明了将CD45阳性细胞暴露于各种应激并通过FACS分析Oct4-GFP表达。应激处理之后在存活细胞中Oct4-GFP表达细胞的百分比(n＝3，平均值+S.D.)。图5B描绘了pH值条件的确定。将CD45阳性细胞暴露于不同的pH溶液。应激处理后第3天，通过FACS分析Oct4-GFP表达。图5C描绘了培养条件的确定。在各种培养基中培养应激处理的细胞。在第14天对GFP表达AC的数量进行计数(n＝3，平均值±S.D.)。图6A-6B描绘了由来源于ICR小鼠的CD45阳性细胞的ACC生成。图6A描绘了应激处理之后CD45阳性细胞随时间顺序的变化。通过FACS分析E-钙粘蛋白和SSEA-1的表达。图6B表明通过RT-PCR证实了E-钙粘附蛋白/SSEA1双阳性细胞的Oct4基因表达(n＝3，平均值+S.D.)。图7A-7B描绘了由来源于GOF小鼠的多种组织的A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.表达一种或多种多能性标志物的细胞制备用于治疗神经损伤的药物的用途，其中，所述表达一种或多种多能性标志物的细胞是通过以下来从分化的非胚胎体细胞诱导：暴露于与其他化学或机械应激组合的包括三磷酸腺苷(ATP)的有效量的化学应激以使应激基因的水平增加一定量和一定时间使得有效地增加所述表达一种或多种多能性标志物的细胞的数量，/n其中，所述用途的特征在于将所述表达一种或多种多能性标志物的细胞鞘内注射于神经损伤的个体中。/n

【技术特征摘要】
20140319 US 61/955,358;20140319 US 61/955,362;20141.表达一种或多种多能性标志物的细胞制备用于治疗神经损伤的药物的用途，其中，所述表达一种或多种多能性标志物的细胞是通过以下来从分化的非胚胎体细胞诱导：暴露于与其他化学或机械应激组合的包括三磷酸腺苷(ATP)的有效量的化学应激以使应激基因的水平增加一定量和一定时间使得有效地增加所述表达一种或多种多能性标志物的细胞的数量，
其中，所述用途的特征在于将所述表达一种或多种多能性标志物的细胞鞘内注射于神经损伤的个体中。


2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述神经损伤是神经疼痛。


3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述神经损伤是脊髓神经损伤。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中，所述细胞通过暴露于5至6之间的pH来诱导。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其中，所述细胞通过以下步骤诱导：使细胞悬浮液以有效增加表达多能性标志物的细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：查尔斯·A·瓦坎蒂，科吉·考吉玛，
申请(专利权)人：V细胞治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US