【技术实现步骤摘要】
一种利用Transwell构建小鼠肠道上皮体外单层培养及表征方法
本专利技术涉及一种利用Transwell构建小鼠肠道上皮体外单层培养及表征方法。
技术介绍
小肠作为人体最大的营养物质吸收器官,肠道层面的营养物质感受、吸收、转运日益受到关注。目前用于小肠营养物感受、转运、吸收功能评价体外模型主要分为两类:一类是以肠道组织为基础的模型,主要以尤斯灌流系统为主;一类是以肿瘤细胞系为基础的模型,主要以Caco-2或Caco-2与HT29联合培养结合跨膜分析技术(Transwell)可以产生极化上皮层,用于体外上皮细胞反应研究。但是上述肠道功能体外研究模型均存在一定缺陷,基于肿瘤细胞系的模型细胞种类单一,无法真实再现肠道多细胞组成特征,缺乏细胞与细胞之间相互作用,容易造成吸收评价的过度评估;而以肠道组织基础上的模型,存在技术要求高、动物使用量大、实验重复性和稳定性相对较差、体外测试时间有限问题。肠道干细胞的发现及体外3D培养技术的建立为上述问题的解决提供了新的思路,但是现有的以肠道干细胞为基础体外培养的肠道类器官,细胞顶端位于3D结构内测,上述特点大大限制了该模型在营养物质吸收、转运评价层面的应用。
技术实现思路
有鉴于此,本专利技术的目的在于提供一种利用Transwell构建小鼠肠道上皮体外单层培养及表征方法。该方法区别于现有技术,将含有肠道干细胞的肠道隐窝与其滋养细胞肌成纤维细胞接种于Transwell嵌套不同表面共培养快速形成了体外肠道单层培养模型,进一步地,此方法获得的肠道单层培养模型具有 ...
【技术保护点】
1.一种利用Transwell构建小鼠肠道上皮体外单层培养,其特征在于所述的培养方法包括以下几个步骤:/n步骤一、肠道隐窝结构分离:收集8周大ICR小鼠小肠7-8cm,使用含冰上预冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液的10ml注射器清洗至清洗液中无肉眼可见残渣;将肠道沿纵轴剖开放入冰上放置的含无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液的100mm培养皿1中,使用眼科剪将肠道剪成0.5-1cm的肠段,将剪好肠段转移至含有10ml冰上预冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液的15ml离心管1中,将离心管1上下颠倒10-20次,随后静置至肠段沉于离心管1底部后去除上清,按照上述方法反复清洗3次去除上清;将清洗的组织转移至含有20ml浓度为5mM的乙二胺四乙酸溶液的50ml离心管2中;将50ml离心管2置于37℃气浴摇床250rpm转速振荡10分钟进行消化;消化结束后将离心管2中乙二胺四乙酸溶液去除,加入冰上预冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液清洗肠道组织一次后去除溶液,向离心管2中加入10ml新的磷酸盐缓冲液手动上下振荡离心管2,静置至肠段沉于离心管2底部后去除离心管2中上清,再向离心管2中加入20ml冰上预冷的无钙、镁离子 ...
【技术特征摘要】
1.一种利用Transwell构建小鼠肠道上皮体外单层培养,其特征在于所述的培养方法包括以下几个步骤:
步骤一、肠道隐窝结构分离:收集8周大ICR小鼠小肠7-8cm,使用含冰上预冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液的10ml注射器清洗至清洗液中无肉眼可见残渣;将肠道沿纵轴剖开放入冰上放置的含无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液的100mm培养皿1中,使用眼科剪将肠道剪成0.5-1cm的肠段,将剪好肠段转移至含有10ml冰上预冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液的15ml离心管1中,将离心管1上下颠倒10-20次,随后静置至肠段沉于离心管1底部后去除上清,按照上述方法反复清洗3次去除上清;将清洗的组织转移至含有20ml浓度为5mM的乙二胺四乙酸溶液的50ml离心管2中;将50ml离心管2置于37℃气浴摇床250rpm转速振荡10分钟进行消化;消化结束后将离心管2中乙二胺四乙酸溶液去除,加入冰上预冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液清洗肠道组织一次后去除溶液,向离心管2中加入10ml新的磷酸盐缓冲液手动上下振荡离心管2,静置至肠段沉于离心管2底部后去除离心管2中上清,再向离心管2中加入20ml冰上预冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液,手动用力振荡离心管240-50次,同样静置后将上清通过100微米孔径细胞筛转移至新的50ml离心管3中;离心管3以20g转速在4摄氏度下离心10分钟,离心结束后去除离心管3中上清,向离心管3中加入1ml培养基1,随后置于冰上备用;
步骤二、复合凝胶处理Transwell嵌套:按照体积比1:30的比例将复合凝胶和冷的无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液稀释到1.5ml离心管4中,置于冰上备用;向含有Transwell的嵌套的24培养板1中嵌套的上表面加入100微升离心管4中稀释液,随后将培养板1放入37℃二氧化碳培养箱静置孵育2h,孵育结束后去除培养板1嵌套上表面溶液备用;
步骤三、肌成纤维细胞细胞接种:将复合凝胶处理好的Transwell嵌套从培养板1转移至6孔培养板2中,Transwell嵌套翻转倒置,嵌套下表面朝上,随后将100微升浓度为每毫升105个细胞的细胞悬液接种于培养板2中的嵌套下表面,将培养板2置于37℃二氧化碳培养箱静置孵育2h;孵育结束后将Transwell嵌套重新正置转移至新的24孔培养板3中,然后向嵌套下室加入500毫升培养基2,备用;
步骤四、肠道上皮体外单培养:取步骤一中获得的含有肠道隐窝的离心管3中溶液200微升,接种于步骤三中接种过肌成纤维细胞的培养板3中的嵌套的上室中,随后将培养板3置于37℃二氧化碳培养箱中培养,培养过程中每天更换一次Transwell嵌套上、下室的培养基1和2。
2.根据权利要求1中所述的方法,其特征在于步骤一、四中所述培养基1由50%体积比例的Wint3a条件培养基、5%体积比例的R-spondin条件培养基、DMEM/F12培养基、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、表皮生长因子、神经元细胞培养补充剂N2和B27、烟酰胺、Rho相关形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶卷曲螺旋抑制剂Y27632组成。
3.根据权利要求1中所述的方法,其特征在于步骤二中所述复合凝胶由粘连蛋白和胶原蛋白I组成。
4.根据权利要求1中所述的方法,其特征在于步骤三、四中所述培养基2由DMEM高糖培养基、非必须氨基酸溶液、青霉素、链霉素组成。
5.一种利用Transwell构建小...
【专利技术属性】
技术研发人员:秦玉梅,郭庆斌,毛岳忠,田师一,韩剑众,
申请(专利权)人:浙江工商大学,
类型:发明
国别省市:浙江;33
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