一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法技术

本发明专利技术提供一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法，利用温敏凝胶培养，在不标记小鼠输卵管内膜干细胞的膜蛋白的情况下分离小鼠输卵管内膜干细胞，具体步骤如下：1)输卵管全细胞准备；2)将步骤1)中的全细胞进行原代培养；3)将步骤2)中的分离得到的细胞团进行回收；4)采用非石蜡切片法鉴定分离的细胞为小鼠输卵管内膜干细胞，本发明专利技术摒弃抗体标记等化学物质的处理，直接将全细胞播种于温敏凝胶中使输卵管内膜干细胞在凝胶中增殖并形成细胞团，直接回收细胞团便达到一次性分离和增殖输卵管内膜干细胞的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法。
技术介绍
输卵管是精卵授精的地方，其内膜随着发情周期的变化而被破坏、重建。输卵管内膜干细胞在这破坏重建的过程中起到了非常重要的作用。最近发现，某些高危卵巢癌的病因是起源于输卵管的分泌细胞系，因此研究输卵管内膜干细胞对此类疾病的解析非常关键。对输卵管内膜干细胞的分离一直是困扰人们的课题，直到2012年DanielPaik利用流式分选法在人的输卵管分离出人输卵管内膜干细胞。但这分离方法也是分离干细胞的一个障碍，不仅要用到价格高昂的流式细胞仪，还要对细胞进行物理和化学的处理，从而破坏分离细胞的原始性，影响后续的培养实验。凝胶培养细胞可以阻碍细胞的流动，使细胞在固定的位置生长。温敏凝胶是人工合成的具有生物相容性的聚合物，其在小于20℃时是液态，高于20℃时转变为固态。本研究利用温敏凝胶来无标记分离小鼠输卵管内膜干细胞。采用传统分离小鼠输卵管内膜干细胞，标记后FACS分选方法分离小鼠输卵管内膜干细胞时，用多种抗体及化学物质标记细胞，然后用流式细胞仪分选并收集所标记的细胞，存在生产成本高，操作复杂，细胞污染率高，对样本数量的依赖性高等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法，利用温敏凝胶培养，在不标记小鼠输卵管内膜干细胞的膜蛋白的情况下分离小鼠输卵管内膜干细胞，具体步骤如下：1)输卵管全细胞准备；2)将步骤1)中的全细胞进行原代培养；3)将步骤2)中的分离得到的细胞团进行回收；4)采用非石蜡切片法鉴定分离的细胞为小鼠输卵管内膜干细胞。进一步，步骤1)中所述输卵管全细胞准备的具体步骤为：6-8周龄ICR雌鼠断颈处死取输卵管，在含有2mlDPBS溶液35mm培养皿中将小鼠输卵管组织撕碎，离心收集碎片，在37℃环境中用0.25mg/ml的胶原酶的1mlPBS消化分散细胞。消化25分钟后，加入4ml含10％FBS的PrEGM培养基，吹打并混匀细胞，然后通过40μm网经的细胞滤器。将通过滤器的单细胞溶液300g离心5分钟，弃上清后用PrEGM培养基培养液将输卵管全细胞稀释至浓度为1×107/ml。进一步，步骤2)中所述将步骤1)中的全细胞进行原代培养的具体步骤为：将0.1ml输卵管全细胞混合液与0.9ml温敏凝胶混合，使细胞的最终浓度为1×106/ml，取0.2～0.25ml于12孔培养板中并置于37℃培养箱中使凝胶凝固，每孔加入1ml的PrEGM或DMEM/F12全培养基，在5％CO2、37℃环境中培养6～12天，凝胶中可见许多细胞聚集而成的细胞团Ⅰ。进一步，步骤3)中所述将步骤2)中的分离得到的细胞团进行回收的具体步骤为：将培养6-12天后的细胞团Ⅰ的12孔培养板放入冰上5分钟，溶解温敏凝胶并回收，加入冰PBS至10ml，300g离心5分钟，弃上清，用10ml冰PBS重新悬浮细胞团并离心，得到细胞团Ⅱ。进一步，步骤3)中所述采用非石蜡切片法鉴定分离的细胞为小鼠输卵管内膜干细胞的具体步骤为：取细胞团Ⅱ加入含10％FBS，50μMEdU的PrEGMBulletKit1ml，继续培养6小时，使EdU插入到合成的DNA中，然后回收细胞团Ⅱ，EdU插入培养的细胞团Ⅱ用-20℃甲醇固定，室温环境中加入Apollo反应液并轻轻摇晃6小时使其与插入的EdU反应均匀，然后用Hoechst33342染细胞核，得到待观察物Ⅰ，避光保存备用；取细胞团Ⅱ用-20℃的甲醇固定5小时，然后用含有0.2％Triton-100的冷PBS(PBST)洗2次，将细胞团Ⅱ放入含10％山羊血清的PBST中封闭孵育3小时，加入含1：200anti-EpCAM的PBST溶液，4℃冰箱内过夜孵育。用含1％山羊血清的PBST清洗2次，每次5分钟，300g离心5分钟。细胞团沉淀用含1：400山羊抗小鼠IgG二抗的PBST室温培养2小时，PI复染细胞核，得到待观察物Ⅱ，避光保存备用；分别取50μl的待观察物Ⅰ和待观察物Ⅱ放入玻璃底培养皿中，置于共聚焦载物台上静止1-2分钟，观察并拍照。由于采用了上述技术方案，本专利技术具有如下的优点：本专利技术摒弃抗体标记等化学物质的处理，直接将全细胞播种于温敏凝胶中使输卵管内膜干细胞在凝胶中增殖并形成细胞团，直接回收细胞团便达到分离输卵管内膜干细胞的目的，其优点在于：1、大大节约了成本。传统标记后FACS分选方法所使用的多种抗体的价格比较昂贵，所使用的分选仪器FACS也比较贵重。本研究省略了抗体的标记以及贵重仪器的使用，为输卵管内膜干细胞的分离节约了大量的成本。2、操作更加简便。传统标记后FACS分选方法所使用的仪器操作复杂，需要专门的人员进行操作，仪器维护也需要花费时间和精力。本专利技术非标记分离输卵管内膜干细胞的方法则没有此烦恼，大大简化的分离方法。3、分离后的输卵管内膜干细胞更加安全。传统标记后FACS分选方法使用多种抗体及化学物质处理细胞，这对细胞有一定的毒性，影响细胞的活力并且影响后续的研究。而本专利技术所使用的方法不经过任何化学物质处理细胞，使细胞保持原来的活力，不影响后续的研究。4、减少了细胞污染的几率。传统标记后FACS分选方法由于要经过仪器的分选，增加了污染的几率，而本专利技术方法不经过仪器分选，减少了因仪器操作而导致的污染机会。5、减少了对样本数量的依赖。由于输卵管内膜干细胞的数量在输卵管全细胞中所占的比例比较小，传统标记后FACS分选方法需要大量的细胞才能分选出一定数量的输卵管内膜干细胞。而本专利技术所使用的非标记法，将分选和扩增结合，使用少量的样本经培养一步达到扩增和分离输卵管内膜干细胞的目的。附图说明图1为本专利技术的流程图；图2为输卵管内膜干细胞的标记物在输卵管的内膜层分布结果图；图3为输卵管全细胞在温敏凝胶中经过6天的培养结果图；图4为细胞团的细胞经EdU染色结果图；图5为细胞团的细胞鉴定为输卵管内膜干细胞的结果图；图6为传统标记FACS分离法结果图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1：一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法，如图1所示1、实验动物选用清洁级健康6-8周龄ICR雌性小鼠30只，由福建医科大学实验动物中心提供。2、实验试剂EdU试剂盒、小鼠anti-EpCAM、山羊抗小鼠IgG、MebiolGel温敏凝胶、PrEGMBulletKit。3、实验方法3.1输卵管全细胞准备6-8周龄ICR雌鼠断颈处死取输卵管，在含有2mlDPBS溶液35mm培养皿中将小鼠输卵管组织撕碎，离心收集碎片，在37℃环境中用0.25mg/ml的胶原酶的1mlPBS消化分散细胞。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法，其特征在于，利用温敏凝胶培养，在不标记小鼠输卵管内膜干细胞的膜蛋白的情况下分离小鼠输卵管内膜干细胞，具体步骤如下：/n1)输卵管全细胞准备；/n2)将步骤1)中的全细胞进行原代培养；/n3)将步骤2)中的分离得到的细胞团进行回收；/n4)采用非石蜡切片法鉴定分离的细胞为小鼠输卵管内膜干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法，其特征在于，利用温敏凝胶培养，在不标记小鼠输卵管内膜干细胞的膜蛋白的情况下分离小鼠输卵管内膜干细胞，具体步骤如下：
1)输卵管全细胞准备；
2)将步骤1)中的全细胞进行原代培养；
3)将步骤2)中的分离得到的细胞团进行回收；
4)采用非石蜡切片法鉴定分离的细胞为小鼠输卵管内膜干细胞。


2.如权利要求1所述的一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法，其特征在于，步骤1)中所述输卵管全细胞准备的具体步骤为：6-8周龄ICR雌鼠断颈处死取输卵管，在含有2mlDPBS溶液35mm培养皿中将小鼠输卵管组织撕碎，离心收集碎片，在37℃环境中用0.25mg/ml的胶原酶的1mlPBS消化分散细胞。消化25分钟后，加入4ml含10％FBS的PrEGM培养基，吹打并混匀细胞，然后通过40μm网经的细胞滤器。将通过滤器的单细胞溶液300g离心5分钟，弃上清后用PrEGM培养基培养液将输卵管全细胞稀释至浓度为1×107/ml。


3.如权利要求2所述的一种非标记法分离小鼠输卵管内膜干细胞的方法，其特征在于，步骤2)中所述将步骤1)中的全细胞进行原代培养的具体步骤为：将0.1ml输卵管全细胞混合液与0.9ml温敏凝胶混合，使细胞的最终浓度为1×106/ml，取0.2～0.25ml于12孔培养板中并置于37℃培养箱中使凝胶凝固，每孔加入1ml的PrEGM或DMEM/F12全培养基，在5％CO2、37℃环境中培养6～12天，凝胶中可见许多细胞聚集而成的细胞团Ⅰ。


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【专利技术属性】
技术研发人员：杨信志，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建;35