一种基于结合化合物的间充质干细胞分离的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于结合化合物的间充质干细胞分离的方法，其包括：从癌细胞的器官样本制备细胞悬液后将其封装在包覆琼脂糖的培养基中；在培养基中实现细胞传代培养；使所述细胞培养基悬液与Lgr6型和/或Lgr5型结合化合物接触，然后使所述细胞与相应的抗癌化学治疗剂接触至一定时间；量取间充质干细胞上清液，经外泌体分离纯化后，从所述培养基悬液中取出存活细胞，鉴定所述细胞是否与结合化合物结合；将所述间充质干细胞与所述结合化合物分离。本发明专利技术还涉及获得的干细胞和它们在用于制备治疗受损或患病组织的药物中的用途。备治疗受损或患病组织的药物中的用途。备治疗受损或患病组织的药物中的用途。

【技术实现步骤摘要】
一种基于结合化合物的间充质干细胞分离的方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，尤其是涉及一种基于结合化合物的间充质干细胞分离的方法。

技术介绍

[0002]目前，癌症已经成为世界各国患者的重要死因，而目前化学治疗仍是最为常见的手段之一。在化学治疗和缓解后来自癌症的大多数死亡起因于一种或多种原始治疗肿瘤的复发。AACR规定间充质干细胞“是肿瘤内的细胞，具有自我更新和产生组成肿瘤的癌细胞的异质谱系的能力。因此间充质干细胞只能够依据它们重演不断生长的肿瘤的产生的能力试验性地定义”。
[0003]大多数抗癌小分子化合物都具有高亲油性和低水溶性，导致其生物利用率低，这常被认为是这些抗癌药物开发和临床应用的一个关键障碍。表面受体Lgr5型和Lgr6型在多种组织标记成体干细胞，并且在多种类型的癌症中标记间充质干细胞。目前研究发现间充质干细胞外泌体具有与干细胞相似的治疗效果，具有易于冻存、运输、定量和移植等优势，且由于其能在细胞间传递的众多生物活性分子，被认为具有良好的作为药物递送载体的潜力。然而，尚无间充质干细胞外泌体分离并用于干细胞治疗的有效手段及其应用的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种基于结合化合物的间充质干细胞分离的方法，能够间充质干细胞及外泌体的有效分离并用于干细胞治疗的应用。
[0005]本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一方面，提供基于结合化合物的间充质干细胞分离的方法，其包括：(a)从癌细胞的器官样本制备细胞悬液后将其封装在包覆琼脂糖的培养基中；在培养基中实现细胞传代培养；
[0006](b)使所述细胞培养基悬液与Lgr6型和/或Lgr5型结合化合物接触，然后使所述细胞与相应的抗癌化学治疗剂接触至一定时间；
[0007](c)量取间充质干细胞上清液，经外泌体分离纯化后，从所述培养基悬液中取出存活细胞，鉴定所述细胞是否与结合化合物结合；
[0008](d)将所述间充质干细胞与所述结合化合物分离。
[0009]根据本专利技术的一些实施例，所述干细胞是胃干细胞、肝干细胞或肺干细胞中的一种。
[0010]根据本专利技术的一些实施例，所述间充质干细胞是脂肪间充质干细胞(ADSCs)。
[0011]根据本专利技术的一些实施例，所述步骤a中的培养基由DMEM/F12、缓冲液和少量霉素混合液配制。
[0012]根据本专利技术的一些实施例，所述步骤b中的所述结合化合物为能够结合Lgr5型或Lgr6型的至少两种不同的抗体或抗体衍生物或抗体片段。
[0013]根据本专利技术的一些实施例，所述步骤b中的所述抗癌化学治疗剂为丝裂霉素或紫杉醇。
[0014]根据本专利技术的一些实施例，所述步骤c中，分离纯化步骤具体包括：量取250毫升间充质干细胞的细胞上清液，经离心去除细胞碎片等沉淀；用真空循环水泵在1bar的负压表压下，将离心后的上清液用0.2微米孔径的PES滤膜完全过滤。
[0015]根据本专利技术的一些实施例，所述细胞是对于丝裂霉素有抗性的。
[0016]根据本专利技术的一些实施例，所述癌细胞是哺乳动物细胞。
[0017]本专利技术还提供一种应用分离后的间充质干细胞的方法，间充质干细胞采用上述任一项的方法制备，并且应用于胃癌、肝癌或肺癌中的一种。
[0018]本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种基于结合化合物的间充质干细胞分离的方法，能够使间充质干细胞及外泌体的有效分离并用于干细胞治疗的应用。结果提示，该方法分离的间充质干细胞外泌体具有在肿瘤治疗上的应用前景，并可用于药物递送增强其抗肿瘤效应。
附图说明
[0019]附图1是本专利技术实施例基于结合化合物的间充质干细胞分离的方法步骤。
具体实施方式
[0020]以下将结合实施例对本专利技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本专利技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本专利技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本专利技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本专利技术保护的范围。
[0021]实施例1
[0022]步骤a、从癌细胞的器官样本制备细胞悬液后将其封装在包覆琼脂糖的培养基中；在培养基中实现细胞传代培养。
[0023]选取胃干细胞、肝干细胞或肺干细胞中的一种，将至少大于3代的ADSCs接种于含有10
‑
15毫升DMEM/F12完全培养基的T75细胞培养瓶(TC，透气盖)中，在室温下、二氧化碳浓度为5％的条件下在二氧化碳培养箱中进行初始的培养步骤。培养基由DMEM/F12、缓冲液和少量霉素混合液配制。琼脂糖包覆的、含RENCA细胞的琼脂糖珠依照Smith等人，Cane Res.，71(3)：716
‑
724(2011)；和Smith等人，Cane.Res.71(3)：725
‑
735(2011)进行制备，该制备方式为本领域现有技术。
[0024]在培养期间，保证每48h更换一次上述的细胞培养基，期间采用室温条件下的进行恒温水浴过的PBS缓冲液(PH＝7.4
‑
7.8)对细胞表面进行初步的清洗，清洗次数可以选择1～2次。上述所有步骤完成后，等待细胞生长至85％～92％的有效汇合度时，进行细胞的传代培养。
[0025]接下来，待ADSCs细胞生长至85％～92％汇合度时，舍弃上清，用PBS缓冲液再次清洗细胞表面1～2次，加入1
‑
3毫升胰蛋白酶，置于二氧化碳培养箱中，在室温下、二氧化碳浓度为5％的条件下，消化2.5
‑
3.5分钟。随后在倒置医学显微镜下观察，发现细胞变圆并开始脱离壁面时，加入5
‑
7毫升DMEM/F12完全培养基，经吹打混匀后形成细胞悬液，并离心5分
钟。弃上清，加入2毫升完全培养基混匀，按1：2.5比例传代至T75瓶中培养。
[0026]随后使上述的样品暴露于以三个可变浓度之一的单一的已知抗癌药物。暴露涉及基于药物已知的半衰期，使其在药物的存在下温育一段时间。
[0027]步骤b、使所述细胞培养基悬液与Lgr6型和/或Lgr5型结合化合物接触，然后使所述细胞与相应的抗癌化学治疗剂接触至一定时间。
[0028]抗癌化学治疗剂可以选择细胞毒类的药物中的化疗药物，例如顺铂、卡铂、紫杉醇、氟尿嘧啶、丝裂霉素等，优选丝裂霉素和紫杉醇，用其处理不破坏封装的肿瘤集落内的所有细胞。紫杉醇和丝裂霉素处理的珠在标准条件下培养，如已暴露于[CH3]2
‑
S
‑
0的对照组一样，所述[CH3]2
‑
S
‑
0是用于递送两种药物的载体。
[0029]Lgr5型或Lgr6型结合化合物的能够结合Lgr5型或Lgr6型的抗体，或者抗体衍生物，或抗体片段，即对Lgr5型或Lgr6型具有亲和力的抗体或其衍生物或片段。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于结合化合物的间充质干细胞分离的方法，其特征在于，包括：(a)从癌细胞的器官样本制备细胞悬液后将其封装在包覆琼脂糖的培养基中；在培养基中实现细胞传代培养；(b)使所述细胞培养基悬液与Lgr6型和/或Lgr5型结合化合物接触，然后使所述细胞与相应的抗癌化学治疗剂接触至一定时间；(c)量取间充质干细胞上清液，经外泌体分离纯化后，从所述培养基悬液中取出存活细胞，鉴定所述细胞是否与结合化合物结合；(d)将所述间充质干细胞与所述结合化合物分离。2.根据权利要求1所述的间充质干细胞分离的方法，其特征在于，所述干细胞是胃干细胞、肝干细胞或肺干细胞中的一种。3.根据权利要求1所述的间充质干细胞分离的方法，其特征在于，所述间充质干细胞是脂肪间充质干细胞(ADSCs)。4.根据权利要求1所述的间充质干细胞分离的方法，其特征在于，所述步骤a中的培养基由DMEM/F12、缓冲液和少量霉素混合液配制。5.根据权利要求1所述的间充质干细胞分离的方法，其特征在于，所述步...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭伟群，曹小伍，邵草品，方梓馨，李禅，
申请(专利权)人：杭州憶盛医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：