一种基于氧浓度梯度的自体脂肪干细胞外泌体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种基于氧浓度梯度的自体脂肪干细胞外泌体及其制备方法与应用。本发明专利技术提供了脂肪干细胞外泌体的制备方法，包括：将脂肪干细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；收集培养上清，并分离纯化得到脂肪干细胞外泌体。本发明专利技术基于氧浓度梯度培养技术，极限刺激脂肪干细胞的增殖能力和应激分泌功能性外泌体的潜能，通过离心浓缩、纳米膜过滤分离富含干细胞外泌体的上清原液，最大限度保留干细胞培养上清中促进细胞生长的营养成分和活性因子，去除其他大分子蛋白、细胞碎片等难吸收成分，具有显著修复护理功效，有效改善头皮毛发再生修复的微环境。有效改善头皮毛发再生修复的微环境。

【技术实现步骤摘要】
一种基于氧浓度梯度的自体脂肪干细胞外泌体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种基于氧浓度梯度的自体脂肪干细胞外泌体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]毛发由毛干和毛根两部分组成。伸出皮肤外面的部分称为毛干，埋在皮肤内部的称为毛根。毛发缺损包括自然的雄激素性毛发脱失、烧伤性毛发缺损、创伤性毛发缺失、医源性毛发缺失等。毛发缺损的修复方法有很多：头皮扩张、头皮缩减、头皮条游离移植、皮瓣法、自体毛发移植法。此类修复方法都可以修复毛发缺失，但是，毛发移植物较大，因而产生术后毛发方向和密度分布不自然、受区损伤大、存活率低、影响美观等缺点。
[0003]外泌体(exosomes)是一种由多种细胞在正常或病理状态下分泌的微小囊泡，直径在30
‑
150nm，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷而形成的多囊泡体，多囊泡体外膜与细胞膜融合后，通过类似出芽的方式释放到胞外基质中，具有脂质双层膜结构。外泌体内含复杂的RNA和蛋白质，在机体免疫应答、抗原呈递、细胞分化、细胞间信息传递、肿瘤生长和侵袭、组织稳态调控等方面发挥重要作用。与干细胞相比，干细胞外泌体更稳定，更安全，保存更方便，质量更好控制，有望成为一种新的治疗方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种基于氧浓度梯度的自体脂肪干细胞外泌体及其制备方法与应用。
[0005]第一方面，本专利技术要求保护一种脂肪干细胞外泌体的制备方法。
[0006]本专利技术要求保护的脂肪干细胞外泌体的制备方法，可包括如下步骤：
[0007](I)将脂肪干细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度包括低氧和高氧；所述低氧是指氧气浓度低于20.9％(空气标准含氧量)，所述高氧是指氧气浓度高于20.9％(空气标准含氧量)。
[0008](II)收集经步骤(I)培养后的脂肪干细胞或其经传代后的脂肪干细胞的培养上清，并分离纯化得到脂肪干细胞外泌体。
[0009]其中，所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度是指氧气浓度从4％至32％。
[0010]在本专利技术中，所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度设置具体如下：4％、8％、16％、24％、28％和32％。
[0011]在本专利技术中，所述氧气浓度均指体积百分含量。
[0012]步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述脂肪干细胞进行培养时，培养时间均可为10
‑
14h(如12h)；CO2的浓度均可为5％(体积百分含量)；培养温度均可为37℃；采用的培养基均可为无血清干细胞培养基。在本专利技术的具体实施方式中，所述无血清干细胞培养基具体为TheraPEAK
TM
MSCGM
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CD
TM
Mesenchymal Stem Cell Medium,Chemically Defined(中
文名称：TheraPEAK
TM
MSCGM
‑
CD
TM
人间充质干细胞培养基)，产品编码：YS000471，供应商：LONZA公司。
[0013]步骤(I)中，将所述脂肪干细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养前还可包括如下步骤：将所述脂肪干细胞置于无血清干细胞培养基中培养8h。然后再进行PBS洗涤(如洗涤两次)。
[0014]步骤(II)中，可按照包括如下步骤的方法分离纯化得到所述脂肪干细胞外泌体：收集所述脂肪干细胞的培养上清后，先通过低速离心去除完整细胞和死细胞碎片，然后将离心上清液进行高速离心，得到脂肪干细胞外泌体沉淀；所述低速离心为4℃2000g离心8
‑
10min；所述高速离心为4℃100000g离心90min。
[0015]进一步地，还可包括将所述脂肪干细胞外泌体沉淀悬浮于PBS溶液后，依次使用0.45μm和0.22μm滤器先后进行过滤的步骤，所得滤液为富含脂肪干细胞外泌体的原液。
[0016]第二方面，本专利技术要求保护利用前文第一方面所述方法制备得到的脂肪干细胞外泌体或富含脂肪干细胞外泌体的原液。
[0017]第三方面，本专利技术要求保护一种生发注射液。
[0018]本专利技术要求保护的生发注射液由前文第二方面所述的富含脂肪干细胞外泌体的原液和注射用生理盐水配制而成；每毫升所述生发注射液中至少含有由1
×
105个脂肪干细胞产生的外泌体(即按照前文第一方面所述方法制备外泌体)。
[0019]进一步地，每毫升所述生发注射液中含有由1
×
105个脂肪干细胞产生的外泌体(即按照前文第一方面所述方法制备外泌体)。
[0020]第四方面，本专利技术要求保护如下任一应用：
[0021]P1、前文第二方面所述的脂肪干细胞外泌体或富含脂肪干细胞外泌体的原液在制备前文第三方面所述生发注射液中的应用。
[0022]P2、前文第二方面所述的脂肪干细胞外泌体或富含脂肪干细胞外泌体的原液或前文第三方面所述生发注射液在生发(即毛发再生)中的应用。
[0023]P3、前文第二方面所述的脂肪干细胞外泌体或富含脂肪干细胞外泌体的原液或前文第三方面所述生发注射液在组织修复中的应用。
[0024]第五方面，本专利技术要求保护如下任一方法：
[0025]方法A、一种提高脂肪干细胞增殖能力的方法，包括前文第一方面所述方法中的步骤(I)，得到增殖能力提高的脂肪干细胞。
[0026]经所述步骤(I)培养后的脂肪干细胞的增殖能力比在正常氧浓度(20.9％)条件下(除了氧浓度不同外，其余条件均相同)培养的脂肪干细胞的增殖能力更强。
[0027]方法B、一种提高脂肪干细胞组织修复能力的方法，包括前文第一方面所述方法中的步骤(I)，经步骤(I)培养后的脂肪干细胞分泌的外泌体的组织修复能力提高。
[0028]经所述步骤(I)培养后的脂肪干细胞分泌的外泌体的组织修复能力比在正常氧浓度(20.9％)条件下(除了氧浓度不同外，其余条件均相同)培养的脂肪干细胞分泌的外泌体的组织修复能力更强。
[0029]在本专利技术中，所述脂肪干细胞可为商品化的脂肪干细胞，也可为从离体脂肪组织上分离的脂肪干细胞。
[0030]在本专利技术中，所述脂肪干细胞具体可为人脂肪干细胞。
[0031]在本专利技术中，所述脂肪干细胞优选为自体脂肪干细胞。
[0032]本专利技术制备自体脂肪干细胞外泌体，能有效利用自体组织，具有易于操作、无免疫原性反应风险、活性高、效果明显、成本低廉、可操作性强等优点。本专利技术的外泌体是自体脂肪干细胞来源的外泌体，用于调控和恢复毛囊干细胞的功能，实现毛发再生。本专利技术方法取材方便，使用便捷，安全可靠，效果显著。
[0033]本专利技术基于氧浓度梯度培养技术，极限刺激脂肪干细胞的增殖能力和应激分泌功能性外泌体的潜能，通过离心浓缩、纳米膜过滤分离富含干细胞外泌体的上清原液，最大限本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脂肪干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：(I)将脂肪干细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度包括低氧和高氧；所述低氧是指氧气浓度低于20.9％，所述高氧是指氧气浓度高于20.9％；(II)收集经步骤(I)培养后的脂肪干细胞或其经传代后的脂肪干细胞的培养上清，并分离纯化得到脂肪干细胞外泌体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度是指氧气浓度从4％至32％。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度设置如下：4％、8％、16％、24％、28％和32％。4.根据权利要求1
‑
3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述脂肪干细胞进行培养时，培养时间均为10
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14h；和/或步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述脂肪干细胞进行培养时，CO2的浓度均为5％；和/或步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述脂肪干细胞进行培养时，培养温度均为37℃；和/或步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述脂肪干细胞进行培养时，采用的培养基均为无血清干细胞培养基。5.根据权利要求1
‑
4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(I)中，将所述脂肪干细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养前还包括如下步骤：将所述脂肪干细胞置于无血清干细胞培养基中培养8h。6.根据权利要求1
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5中任一所述的方法，其特征在于：步骤(II)中，按照包括如下步骤的方法分离纯化得到所述脂肪干细胞外泌体：收集所述脂肪干细胞的培养上清后，先通过...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗彦军，常国辉，
申请(专利权)人：罗彦军，
类型：发明
国别省市：