本发明专利技术公开了一种成纤维细胞外泌体及其制备方法与应用。本发明专利技术提供了一种制备成纤维细胞外泌体的方法，包括：将成纤维细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；收集培养上清，并分离纯化得到成纤维细胞外泌体。本发明专利技术基于氧浓度梯度培养技术，极限刺激成纤维细胞的增殖能力和应激分泌功能性外泌体的潜能，通过离心浓缩、纳米膜过滤分离富含细胞外泌体的上清原液和细胞裂解液，最大限度保留细胞培养上清中促进细胞生长的营养成分和活性因子，去除其他大分子蛋白、细胞碎片等难吸收成分，并加入具有消炎保湿作用的积雪草苷、玻尿酸等，具有多重修复护理功效，改善皱纹修复的微环境。皱纹修复的微环境。
【技术实现步骤摘要】
一种成纤维细胞外泌体及其制备方法与应用
[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种成纤维细胞外泌体及其制备方法与应用。
技术介绍
[0002]皱纹是由于皮肤真皮层内的胶原蛋白、透明质酸、弹性纤维等物质缺失，无法支撑皮肤的正常架构，皮肤表皮层随之塌陷形成沟壑而形成的。成纤维细胞是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，常附着在胶原纤维上，能合成和分泌大量胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维及有机基质，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用。
[0003]外泌体(exosomes)是一种由多种细胞在正常或病理状态下分泌的微小囊泡，具有脂质双层膜结构，内含复杂的RNA和蛋白质，功能取决于其来源的细胞类型，在机体免疫应答、抗原呈递、细胞分化、细胞间信息传递、组织稳态调控等方面发挥重要作用。与干细胞相比，干细胞外泌体更稳定，更安全，保存更方便，质量更好控制，有望成为一种新的治疗方法。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的是提供一种成纤维细胞外泌体及其制备方法与应用。
[0005]第一方面，本专利技术要求保护一种制备成纤维细胞外泌体的方法。
[0006]本专利技术要求保护的制备成纤维细胞外泌体的方法，可包括如下步骤：
[0007](I)将成纤维细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度包括低氧和高氧；所述低氧是指氧气浓度低于20.9％(空气标准含氧量)，所述高氧是指氧气浓度高于20.9％(空气标准含氧量)；
[0008](II)收集经步骤(I)培养后的成纤维细胞或其经传代后的成纤维细胞的培养上清，并分离纯化得到成纤维细胞外泌体。
[0009]其中，所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度是指氧气浓度从4％至32％。
[0010]在本专利技术的具体实施方式中，所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度设置如下：4％、8％、16％、24％、28％和32％。
[0011]在本专利技术中，所述氧气浓度均指体积百分含量。
[0012]在步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述成纤维细胞进行培养时，培养时间均可为10
‑
14h(如12h)；CO2的浓度均可为5％(体积百分含量)；培养温度均可为37℃；采用的培养基均可为无血清干细胞培养基。在本专利技术的具体实施方式中，所述无血清干细胞培养基具体为TheraPEAK
TM MSCGM
‑
CD
TM Mesenchymal Stem Cell Medium,Chemically Defined(中文名称：TheraPEAK
TM MSCGM
‑
CD
TM
人间充质干细胞培养基)，产品编码：YS000471，供应商：LONZA公司。
[0013]步骤(I)中，将所述成纤维细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养前还可包括如下步骤：将所述成纤维细胞置于无血清干细胞培养基中培养8h。然后
再进行PBS洗涤(如洗涤两次)。
[0014]步骤(II)中，可按照包括如下步骤的方法分离纯化得到所述成纤维细胞外泌体：收集所述成纤维细胞的培养上清，反复冻融，4℃2000g离心8
‑
10min，然后将离心所得上清液过滤，所得滤液中即含有成纤维细胞外泌体。
[0015]进一步地，所述将离心所得上清液过滤具体可为：先用100μm滤网过滤，获得成纤维细胞外泌体粗提液，再用0.22μm滤膜过滤，获得成纤维细胞外泌体精提原液。
[0016]进一步地，所述反复冻融是在
‑
20℃冷冻，常温融化。所述反复冻融的次数可为多次，如3次。所述离心可为多次离心，如2
‑
3次，每次离心后取上清液进行下一次离心。
[0017]第二方面，本专利技术要求保护利用前文第一方面所述方法制备得到的成纤维细胞外泌体或成纤维细胞外泌体精提原液。
[0018]第三方面，本专利技术要求保护一种用于修复皱纹的滋润营养精华液(E液)。
[0019]本专利技术要求保护的用于修复皱纹的滋润营养精华液(E液)，由分别独立包装的B液和D液组成，或者由所述B液和所述D液等体积混合而成(其中所述B液和所述D液的浓度均为：由初始浓度为1
×
106个成纤维细胞/ml按照各自的制备方法所得原液的浓度)。
[0020]所述B液为前文所述的成纤维细胞外泌体精提原液。
[0021]所述D液可按照包括如下步骤的方法制备得到：
[0022](A)按照前文第一方面所述方法中的步骤(I)，将成纤维细胞置于所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；
[0023](B)收集经步骤(A)培养后的成纤维细胞或其经传代后的成纤维细胞，反复冻融，4℃2000g离心8
‑
10min，然后将离心所得上清液先用100μm滤网过滤，获得成纤维细胞裂解粗提液，再用0.22μm滤膜过滤，获得成纤维细胞裂解精提液，即为所述D液。
[0024]步骤(B)中，所述反复冻融是在
‑
20℃冷冻，常温融化。所述反复冻融的次数可为多次，如3次。所述离心可为多次离心，如2
‑
3次，每次离心后取上清液进行下一次离心。
[0025]第四方面，本专利技术要求保护一种用于修复皱纹的成套产品。
[0026]本专利技术要求保护的用于修复皱纹的成套产品，由前文所述滋润营养精华液(E液)和基底液(F液)组成；所述基底液(F液)组成如下：积雪草苷0.92％(质量百分含量)，玻尿酸0.26％(体积百分含量)，甘油0.12％(体积百分含量)，橄榄油0.15％(体积百分含量)，余量为生理盐水。
[0027]第五方面，本专利技术要求保护一种用于修复皱纹的成纤维细胞外泌体敷贴。
[0028]本专利技术要求保护的用于修复皱纹的成纤维细胞外泌体敷贴，可按照包括如下步骤的方法制备得到：在无菌条件下，将所述基底液(F液)附着于蚕丝布表层，随后再将蚕丝布完全浸润入前文由所述B液和所述D液混合而成的所述滋润营养精华液(E液)中，浸润时间为12hs，使得滋润营养精华液能完全浸润于附着有基底液的蚕丝布上，确保滋润营养精华液不失去活性，浸润环境应保持4℃，获得所述成纤维细胞外泌体敷贴。
[0029]进一步地，还可包括如下步骤：无菌条件下，轻轻移取所述成纤维细胞外泌体敷贴，放置于无菌铝箔袋中，封口，低温保存。
[0030]第六方面，本专利技术要求保护如下任一方法：
[0031]方法A、一种提高成纤维细胞增殖能力的方法，包括前文第一方面所述方法中的步骤(I)，得到增殖能力提高的成纤维细胞。
[0032]经所述步骤(I)培养后的成纤维细胞的增殖能力比在正常氧浓度(20.9％)条件下(除了氧浓度不同外，其余条件均相同)培养的成纤维细胞的增殖能力更强。
[0033]方法B、一种提高成纤维细胞外泌体组织修复能力的方法，包括前文第一方面所述方法中的步骤(I)，经步本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种制备成纤维细胞外泌体的方法，包括如下步骤：(I)将成纤维细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养；所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度包括低氧和高氧；所述低氧是指氧气浓度低于20.9％，所述高氧是指氧气浓度高于20.9％；(II)收集经步骤(I)培养后的成纤维细胞或其经传代后的成纤维细胞的培养上清，并分离纯化得到成纤维细胞外泌体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度是指氧气浓度从4％至32％。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述氧气浓度从低到高的系列浓度梯度设置如下：4％、8％、16％、24％、28％和32％。4.根据权利要求1
‑
3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述成纤维细胞进行培养时，培养时间均为10
‑
14h；和/或步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述成纤维细胞进行培养时，CO2的浓度均为5％；和/或步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述成纤维细胞进行培养时，培养温度均为37℃；和/或步骤(I)中，每个氧气浓度梯度下，对所述成纤维细胞进行培养时，采用的培养基均为无血清干细胞培养基；和/或步骤(I)中，将所述成纤维细胞置于氧气浓度从低到高的系列浓度梯度下顺次进行培养前还包括如下步骤：将所述成纤维细胞置于无血清干细胞培养基中培养8h。5.根据权利要求1
‑
4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(II)中，按照包括如下步骤的方法分离纯化得到所述成纤维细胞外泌体：收集所述成纤维细胞的培养上清，反复冻融，4℃2000g离心8
‑
10min，然后将离心所得上清液过滤，所得滤液中即含有成纤维细胞外泌体；进一步地，所述将离心所得上清液过滤为：先用100μm滤网过滤，获得成纤维细胞外泌体粗提液，再用0.22μm滤膜过滤，获得成纤维细胞外泌体精提原液。6.利用权利要求1
‑
5中任一所述方法制备得到的成纤维细胞外泌体或成纤维细胞外泌体精提原液。7.一种用于修复皱纹的滋润营养精华液，由分别独立包装的B液和D液组成，或者由所述B液和所述D液等体积混合而成；所述B液为权利要求6所述的成纤维细胞外泌体精提原液；所述D液按照包括如...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗彦军，常国辉，
申请(专利权)人：罗彦军，
类型：发明
国别省市：
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