一种许氏平鲉成肌细胞的诱导分化方法技术

本发明专利技术涉及一种许氏平鲉成肌细胞的诱导分化方法，属于分子生物学领域。本发明专利技术培养的许氏平鲉成肌细胞能传代培养，用于研究海水硬骨鱼类肌肉生长的基础研究；能有效的进行体外成肌细胞的诱导分化，为体内单核细胞融合成多核细胞的分子机理研究提供基础。核细胞的分子机理研究提供基础。核细胞的分子机理研究提供基础。

【技术实现步骤摘要】
一种许氏平鲉成肌细胞的诱导分化方法


[0001]本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种许氏平鲉成肌细胞的诱导分化方法。

技术介绍

[0002]许氏平鲉(Sebastes schlegelii)，俗称黑鲪、黑头等，是一种重要的海产经济鱼类和增养殖优良品种，主要分布于我国渤海、黄海和东海。许氏平鲉生存温度范围广，能在深水海网箱越冬，是适合北方深水网箱长年养殖的少数几个品种之一，已广泛养殖于北方沿海的深水网箱，但其生长速度慢，通常需要2
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3年才能达到商品规格。生长是对许氏平鲉进行遗传改良最有价值的经济性状之一。鱼类的肌肉占总体重的40％
‑
60％，是主要的食用部分，也是生长性状的核心。研究肌肉生长发育调控相关基因，将为采取相应的技术手段提高肌肉生长速率提供基础。体外培养的肌肉细胞将为研究肌肉生长相关基因的功能验证提供基础实验材料。成肌细胞(Myoblast)是来源于胚胎中胚层的干细胞，具有自我更新和定向分化能力，能够分化形成肌肉细胞。体外培养的成肌细胞可以实现一个完整的肌肉发生过程：增殖、分化、融合和多核肌管的形成。在硬骨鱼中，关于肌肉细胞体外培养的研究主要在鲑类、鲤类和鲷类中进行，但是所培养细胞多为成纤维细胞。与其他脊椎动物相比，海水鱼类成肌细胞的培养及诱导分化方面，尚无相关报道。通过对许氏平鲉成肌细胞的体外培养及诱导分化，将为海水鱼类肌肉生长相关基因的功能验证及生长发育调控机理的研究提供基础实验材料。

技术实现思路

[0003]本专利技术要解决的技术问题在于提供一种许氏平鲉成肌细胞的体外培养、鉴定及诱导分化的方法，为许氏平鲉肌肉生长相关基因的体外验证提供了实验材料，为海水硬骨鱼肌肉生长调控的分子机理研究提供了基础。
[0004]本专利技术所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
[0005]一种许氏平鲉成肌细胞的体外培养方法
[0006]1)许氏平鲉肌肉组织块的取样及消毒：取小块许氏平鲉背肌，移入装有含4％三抗PBS的50ml离心管中；
[0007]2)细胞的原代培养：
①
将组织块从离心管移到装有含4％双抗PBS的25ml容器中，浸泡5min，再依次过含3％、2％、1％三抗PBS的25ml容器中，浸泡5min，期间，间隔搅拌以便组织块和PBS充分接触、灭菌；
②
将组织块移到装有含1％三抗DMEM/F12的容器中；将组织块剪为3mm3大小；
③
将步骤
②
剪碎后的组织块溶液静置，弃掉上部液体，留下部组织块；加入含1％三抗DMEM/F12重悬组织块，静置，再次弃上部液体，重复三次；
④
将组织块转移到培养瓶中，并均匀摆放，倒置培养瓶使组织块紧密结合在培养瓶上，随后将培养瓶正过来加入完全培养基；
[0008]3)细胞的传代培养：
①
原代细胞生长到50－60％丰度时即可进行传代，传代的所
有细胞仍在原培养瓶中培养,第2代细胞生长到75％丰度时即可传代，原瓶培养；三代之后，当细胞覆盖率达到90％时进行传代，一瓶传两到三瓶；
②
传代中用到的包括培养基、胰酶、血清在内的试剂应在24℃培养箱中预热0.5h以上；
③
传代具体步骤：先弃去原培养基，用1ml无血清培养基洗去残留血清、弃去；再加入1ml 0.25％的胰酶处理2
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3min，观察细胞的状态，90％的细胞收缩变为圆形时，震动培养瓶使细胞全部漂浮到培养基中，然后加入血清终止胰酶消化；最后加入完全培养基，混匀，吸细胞悬液传代到另一培养瓶中；
[0009]4)细胞的冻存与复苏：
①
对步骤3)用胰酶消化细胞前，先吸取培养瓶中的培养基，冻存备用；
②
得到的细胞悬液，200g，5min，4℃条件下离心，弃去上清液，用1ml 4℃预冷的完全培养基重悬细胞；
③
先向预冷的冻存管中加入150ul预冷的DMSO，再加入预冷的完全培养基，混匀，然后加入上一步制备好的细胞悬液，混匀
③
冻存的细胞在4℃，1h；
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20℃，3h；
‑
80℃，过夜；液氮中长期保存；
④
将冻存细胞从液氮中取出后，冻存管在37℃下水浴1
‑
2min，待细胞冻存管只剩零星小冰块时停止水浴；
⑤
离心，200g，5min，4℃，弃去上清以去除DMSO，加入新鲜的完全培养基重悬，离心，弃去上清以进一步清洗残余的DMSO，再加入1ml新鲜的完全培养基，重悬；
⑥
将细胞悬液接种到培养瓶中，加入3ml解冻的步骤
①
中冻存备用的培养基，细胞复苏后，需传代两次以上再进行相应实验，细胞相关实验应在2
‑
3d中进行。
[0010]进一步，操作过程中用到的器具都应放在密闭容器中，高温灭菌，整个操作在无菌状态下进行。
[0011]进一步，所述的完全培养基包括以下成分的混合培养基：质量比为1％MEM非必需氨基酸、质量比为1％双抗(10000units/ml青霉素、10mg/ml链霉素)、10ng/mL bFGF、20％胎牛血清，所述的混合培养基为L
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15和DMEM/F12以质量比1：1混合；当细胞传到第10代之后所用的完全培养基中的胎牛血清质量比调成15％，其余成分不变。
[0012]进一步，所述的无血清培养基为包含质量比1％双抗的DMEM/F12培养基。
[0013]进一步，所述的胰酶的浓度为0.25％。
[0014]进一步，所述的分化培养基含有以下成分的混合培养基：质量比1％MEM非必需氨基酸、体积比比1％三抗、质量比2％马血清；所述的混合培养基为L
‑
15和DMEM/F12以质量比1：1混合；
[0015]进一步，所述的三抗(BI,no.PB180424)是由10000units/mL青霉素、10mg/mL链霉素、1250units/mL制霉素组成的混合抗生素；1％的三抗即加1mL三抗到99mL培养基中；所述的双抗为10000units/ml青霉素、10mg/ml链霉素组成的混合抗生素，1％的双抗即加1mL双抗到99mL培养基中；
[0016]本专利技术还提供一种鉴定上述细胞种属的鉴定方法：
①
)细胞的种属鉴定：通过扩增肌肉细胞系18S rRNA基因与许氏平鲉肌肉组织18S rRNA基因比较其同源性确定细胞系来源，设计18S rRNA基因的特异性引物，提取成肌细胞总DNA和许氏平鲉肌肉组织总DNA将PCR产物克隆至PMD
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19T载体，转化至DH5αcell，检测得到阳性单克隆菌株进行测序及比对分析；
②
细胞的类型鉴定：通过扩增肌卫星细胞的标记基因Pax7和成肌细胞的标记基因MyoD来确定细胞类型；Rpl17作为内参基因。使用trizol法，提取细胞总RNA、许氏平鲉肌肉组织本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种许氏平鲉成肌细胞的诱导分化方法，其特征在于所述方法具体步骤如下：
①
获得的传代培养许氏平鲉成肌细胞，0
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24h：设定接种许氏平鲉成肌细胞的时间为0h，0
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24h用生长培养基培养传代细胞，所述的生长培养基为含15％FBS的L
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15培养基，24h时细胞正常生长；24
‑
48h：24h时更换生长培养基为分化培养基，所述的分化培养基为含2％DHS的L
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15培养基，48h时有细胞开始融合；48
‑
72h：使用分化培养基继续培养，72h时有大量细胞融...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺艳，齐洁，孔祥福，张全启，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：