杜仲苷促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的应用及方法技术

本发明专利技术公开了杜仲苷促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的应用及方法，所述方法包括以下步骤：S1、原代脂肪间充质干细胞获取；S2、原代脂肪间充质干细胞体外培养；S3、促进增殖：取二代长满的脂肪间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，待细胞生长，融合度达到80％时，在基础培养基上加入10ng/mL杜仲苷，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养24h；S4、促进成软骨分化：取二代长满的脂肪间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，在基础培养基上加入10ng/mL杜仲苷、10ng/mL TGF

【技术实现步骤摘要】
杜仲苷促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的应用及方法


[0001]本专利技术属于干细胞
，具体涉及杜仲苷促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的应用及方法。

技术介绍

[0002]近年来，随着对脂肪间充质干细胞研究的深入，其在膝骨关节炎治疗中的前景越发突显出来。促进脂肪间充质干细胞的增殖和提高其成软骨分化能力一直是研究的热点和难点。以往研究中多采用一些化学物质及细胞因子来促进脂肪间充质干细胞的增殖和成软骨分化，但由于价格昂贵和安全性问题而无法广泛应用于临床实践中。

技术实现思路

[0003]针对现有技术中心存在的上述问题，本专利技术提供了杜仲苷促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的应用及方法，在促进脂肪间充质干细胞的增殖和成软骨分化的同时又能够降低其成本，安全性好。
[0004]为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的的技术方案是：
[0005]杜仲苷促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的应用，具体为在体外培养体系中加入杜仲苷以促进脂肪间充质干细胞的增殖和成软骨分化。
[0006]进一步地，所述体外培养体系包括高糖DMEM培养基+10％胎牛血清+1％双抗溶液。
[0007]进一步地，向体外培养体系中加入10ng/mL杜仲苷，然后对脂肪间充质干细胞进行培养。
[0008]进一步地，培养条件为5％CO2的培养箱，培养温度为37℃。
[0009]本专利技术还公开了一种促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的体外培养体系，包括杜仲苷。
[0010]进一步地，上述体外培养体系中，杜仲苷的加入量为10ng/mL。
[0011]本专利技术还公开了一种促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的方法，包括以下步骤：
[0012]S1、原代脂肪间充质干细胞获取：
[0013]S1.1、经手术患者知情同意，无菌条件下获取人工膝关节置换手术后患者废弃的髌下脂肪垫，将其移入无菌操作台，用无菌眼科剪剪掉肉眼可见的红色血管以及白色结缔组织，然后将剩余脂肪组织剪成1.0
‑
2.0mm3碎块，DPBS清洗两次，每次5min；
[0014]S1.2、用0.25％胰蛋白酶在37℃消化1h，吸弃0.25％胰蛋白酶，加入用不含血清的高糖DMEM培养基配制的0.2％I型胶原酶溶液，消化过夜；
[0015]S1.2、第2天转移至50mL离心管内，小心吸取下层液体然后经过40μm细胞过滤网过滤，再转移至15mL离心管，1500r/min离心，沉淀用2mL基础培养基溶解并且转入细胞培养瓶中，放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，1
‑
2d后会见到细胞贴壁生长，即得原代脂肪间
充质干细胞；
[0016]S2、原代脂肪间充质干细胞体外培养：将得到的原代脂肪间充质干细胞培养24h后进行半量换液，48h后进行全量换液，之后每2天换液1次，培养5
‑
7d后，原代脂肪间充质干细胞可生长融合达到90％以上，用0.25％胰蛋白酶消化后，按1:3传代接种到新的细胞培养瓶中持续体外培养，即得二代脂肪间充质干细胞；
[0017]S3、促进增殖：取二代长满的脂肪间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，待细胞生长，融合度达到80％时，在基础培养基上加入10ng/mL杜仲苷，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养24h；
[0018]S4、促进成软骨分化：取二代长满的脂肪间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，在基础培养基上加入10ng/mL杜仲苷、10ng/mL TGF
‑
β3、100nmol/L地塞米松、1％ITS
‑
G、50μg/mL维生素C以及40μg/mL脯氨酸，每2天换液1次，连续培养14天。
[0019]进一步地，所述基础培养基包括高糖DMEM培养基+10％胎牛血清+1％双抗溶液。
[0020]相比于现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0021]本专利技术的方法提高了脂肪间充质干细胞的增殖活性和细胞数量，并且提高了脂肪间充质干细胞ACAN、COL2A1、SOX
‑
9基因的表达，体现出了更强的成软骨分化的活性，并且，本专利技术通过在体外培养体系中加入杜仲苷来促进脂肪间充质干细胞的增殖和成软骨分化，相较于现有技术采用化学物质及细胞因子而言，成本更低，安全性更好，进步显著。
附图说明
[0022]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。
[0023]图1中的A为对照组中的脂肪间充质干细胞在96孔板中培养24h后的细胞形态及生长特征图(
×
40)；B为实验组中的脂肪间充质干细胞在96孔板中培养24h后的细胞形态及生长特征图(
×
40)；
[0024]图2中的A为对照组中的脂肪间充质干细胞在6孔板中培养24h后的细胞形态及生长特征图(
×
40)；B为实验组中的脂肪间充质干细胞在6孔板中培养24h后的细胞形态及生长特征图(
×
40)；
[0025]图3中的A为对照组中的脂肪间充质干细胞培养14天后的成软骨诱导分化的细胞形态及生长特征图；B为对照组中的脂肪间充质干细胞培养14天后的成软骨诱导分化的细胞形态及生长特征图。
具体实施方式
[0026]下面将结合实例和附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0027]1.实验器材：
[0028]Cellometer Mini自动细胞计数仪(美国Nexcelom公司)；
[0029]Varioskan Flash全波长多功能酶标仪(美国Thermo公司)；
[0030]3K30冷冻高速离心机(德国Sigma公司)；
[0031]Class II Type B2生物安全柜(新加坡Esco公司)；
[0032]3111CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)；
[0033]DMI8倒置荧光显微镜(德国Leica公司)；
[0034]StepOnePlus实时荧光定量PCR仪(美国Thermo公司)；
[0035]40μm细胞过滤网(美国Biologix公司)。
[0036]2.实验步骤：
[0037]S1、原代脂肪间充质干细胞获取：
[0038]S1.1、经单位伦理委员会批准及手术患者知情同意，无菌条件下获取人工膝关节置换手术后患者废弃的髌下脂肪垫，将其移入无菌操作台，用无菌眼科剪剪掉肉眼可见的红色血管以及白色结缔组织，然后将剩余脂肪组织剪成1.0
‑
2.0mm3碎块，DPBS清洗两次，每次5min；
[0039]S1.2、用0.25％胰蛋白酶在37℃消化1h，吸弃0.25％胰蛋白酶，加入用不含血清的高糖DMEM培养基配制的0.2％I型胶原酶溶液，消化过夜；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.杜仲苷促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在体外培养体系中加入杜仲苷以促进脂肪间充质干细胞的增殖和成软骨分化。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述体外培养体系包括高糖DMEM培养基+10％胎牛血清+1％双抗溶液。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：向体外培养体系中加入10ng/mL杜仲苷，然后对脂肪间充质干细胞进行培养。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：培养条件为5％CO2的培养箱，培养温度为37℃。6.一种促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的体外培养体系，其特征在于：包括杜仲苷。7.根据权利要求6所述的体外培养体系，其特征在于：杜仲苷的加入量为10ng/mL。8.一种促进脂肪间充质干细胞增殖和成软骨分化的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、原代脂肪间充质干细胞获取：S1.1、经手术患者知情同意，无菌条件下获取人工膝关节置换手术后患者废弃的髌下脂肪垫，将其移入无菌操作台，用无菌眼科剪剪掉肉眼可见的红色血管以及白色结缔组织，然后将剩余脂肪组织剪成1.0
‑
2.0mm3碎块，DPBS清洗两次，每次5min；S1.2、用0.25％胰蛋白酶在37℃消化1h，吸弃0.25％胰蛋白酶，加入用不含血清的高糖DMEM培养基配制的0.2％I型胶原酶溶液，消化过夜；S1.2、第2天转移至50mL离心管内，小心吸取下...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚楠，胡子旋，刘文刚，黄丹娥，黄雪君，陈玉兴，
申请(专利权)人：广东省第二中医院广东省中医药工程技术研究院，
类型：发明
国别省市：