一种含干细胞外泌体的生物墨水及其制造方法技术

本发明专利技术提供了一种生物墨水及其制造方法，以及使用生物墨水通过3D打印制造的生物支架，该生物墨水包含甲基丙烯酸酐明胶（gelatin methacryloyl，GelMA）、氧化的透明质酸（oxidized hyaluronic acid，OHA）、多巴胺修饰的透明质酸（dopamine conjugated hyaluronic acid，HA

【技术实现步骤摘要】
一种含干细胞外泌体的生物墨水及其制造方法


[0001]本专利技术属于医疗器械领域，具体涉及含干细胞外泌体的生物墨水及其制造方法。

技术介绍

[0002]关节软骨是运动系统的重要的组成结构之一，与关节内骨端的表面相连接，质地光滑有弹性。关节软骨具有润滑关节、缓冲运动产生的震动和冲击、改善骨与骨的之间的运动和形态匹配，对维持关节正常运动功能至关重要。软骨损伤可以引起剧烈疼痛、关节肿胀、活动能力下降和周围软骨及软骨下骨的退化，甚至发展为骨关节炎，严重影响患者的生活质量，给个人和社会带来沉重的经济负担。随着我国人民群众体育锻炼的热情日益高涨，参与体育活动的种类也逐步扩大，人们发生运动创伤包括关节软骨损伤的机率大大增加。在运动创伤领域，越来越多的患者遭受关节软骨损伤的困扰。软骨缺损在临床常见，有研究显示在接受膝关节镜手术的患者中，有超过 60% 的患者存在软骨缺损。软骨组织没有血管、神经和淋巴分布，其营养来源主要依靠关节滑液和关节囊滑膜层周围的血管供应。因此，软骨损伤后自我修复困难。
[0003]目前，常用的软骨缺损修复的手术策略主要包括微骨折术（microfracture, MF）、自体软骨细胞移植（autologous chondrocyte implantation, ACI）、自体软骨组织移植、同种异体软骨组织移植、干细胞疗法以及组织工程技术等。但是，每种方法都有一定的局限性。许多临床结果表明 MF 和 ACI 方法修复的再生软骨组织主要是纤维软骨组织，并且生物力学性能不如天然的透明软骨。自体软骨组织或者同种异体软骨组织移植修复效果较好，但是由于取材部位容易发生并发症以及来源有限限制了在临床的广泛应用。细胞移植包括 ACI 和干细胞疗法往往需要两个阶段：第一阶段是在体外对自体软骨细胞或者干细胞进行分离、培养和扩增；第二阶段是手术移植到缺损部位。细胞体外扩增过程中的存在去分化、干性降低、衰老，以及高成本、较长的等待时间和二次手术等是细胞疗法临床应用的限制因素。此外，传统的细胞移植在缺损部位不易长期保留也是面临的一个重要问题。目前为止，这些治疗方法均无法完全修复受损的关节软骨。
[0004]有人证实，直接向待修复组织注射外泌体的实验组相比对照组具有更好的修复效果，但是多次注射带来的感染风险以及外泌体悬液在关节腔的弥散降低了其治疗效率。
[0005]传统冻干法难以制备不同空间特异的仿生支架，而3D生物打印技术的出现为精确构建仿生结构以模拟和重塑不同组织的三维空间结构提供了新的方法。脱细胞基质可以模拟其来源组织的生物和结构微环境，提供其再生的理想条件，被认为是组织工程最理想的仿生生物材料。但是，单纯的脱细胞基质材料由于力学强度较低，打印多层后容易出现的“坍塌效应”，导致无法维持仿生支架的空间排布。3D打印的其他生物材料虽然具有一定促进软骨细胞分化并修复软骨损伤的作用，但是最终修复效果欠佳，不具备仿生性能或者仿生性能差。
[0006]因此，需要一种能够解决以上所有或部分问题的方法和产品。

技术实现思路

[0007]本专利技术的第一个方面提供了一种生物墨水，其包含主体材料、软骨脱细胞基质和外泌体，所述主体材料包含甲基丙烯酸酐明胶（gelatin methacryloyl，GelMA）、氧化的透明质酸（oxidized hyaluronic acid，OHA）和多巴胺修饰的透明质酸（dopamine conjugated hyaluronic acid，HA
‑
DA）；可选地，GelMA的质量比例为6%
‑
12%，OHA的质量比例为0.5%
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4%，HA
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DA的质量比例为0.5%
‑
4%，脱细胞基质质量比例为0.5
‑
5%；外泌体为间充质干细胞外泌体，优选地外泌体来自脂肪间充质干细胞（ADSCs），外泌体的终浓度为 10
ꢀ‑
1000μg/mL；优选为100
±
50μg/mL，最优选100μg/mL；可选地，本专利技术的生物墨水还包含光引发剂，其质量比例为0.1
‑
0.5%。
[0008]在一个实施例中，优选地，本专利技术的生物墨水包含质量比例9%的GelMA 、质量比例2%的OHA、2% 的HA
‑
DA、 质量比例2%的脱细胞基质、和质量比例0.4%的光引发剂、以及终浓度为 100 μg/mL的外泌体。
[0009]本专利技术的第二个方面提供了一种生物支架，其使用本专利技术的生物墨水通过3D打印方法制造。
[0010]本专利技术的第三个方面提供了一种生物墨水的制备方法，包括以下步骤：1）称取适量 GelMA 加入 ddH2O 中, 37℃ 搅拌溶解后加入OHA，继续搅拌溶解，得到第一溶液；2）配制 4% 的脱细胞基质墨水，调整 pH 至 7.4后，加入 HA
‑
DA 和 光引发剂，室温搅拌溶解，得到第二溶液；3）将所述第一溶液和所述第二溶液混合均匀获得脱细胞基质生物墨水；4）向所述脱细胞基质生物墨水的中加入间充质干细胞外泌体，使得其终浓度达到预期浓度，得到所述生物墨水；其中步骤1）和2）没有先后顺序。
[0011]进一步地，在一个实施例中，制备生物墨水的方法如下进行：1）称取0.9 g甲基丙烯酸酐明胶加入5 mL的ddH2O 中, 37℃ 搅拌溶解后加入0.2 g氧化的透明质酸，继续搅拌溶解；2）配制 4% 的软骨脱细胞基质墨水5 mL，调整 pH 至7.4后，加入0.2 g多巴胺修饰的透明质酸和0.04 g光引发剂，室温搅拌溶解；3）将上述两种溶液混合均匀获得软骨脱细胞基质生物墨水；4）向所述软骨脱细胞基质生物墨水的中加入外泌体，使得其终浓度为100μg/mL；其中，软骨脱细胞基质墨水的配制如下进行：a）称取15 mg的胃蛋白酶加入5 mL的0.1 M盐酸溶液中，室温搅拌30分钟；b）称取150 mg的软骨脱细胞基质粉末，加入上述含有胃蛋白酶的盐酸溶液，室温密封搅拌 72小时获得软骨脱细胞基质墨水。试剂的使用量根据总量确定，前述质量仅仅是一个具体实例，可以成比例放大或者缩小。
[0012]该实施例中的质量仅仅作为例子，按照相同的比例可以制备不同需求的墨水体积是本领域人员所知晓的。
[0013]本专利技术的优点至少在于：
0.01,***P<0.001。
[0024]图13示出根据本专利技术的方法制作的各组支架上BMSCs体外成软骨分化的评估。图13A
‑
图13D.体外诱导成软骨分化7d和14d软骨相关基因ACAN、COLII、SOX9、COLX的mRNA表达分析，n=5；图13E.诱导成软骨分化14d后COLII和SOX9蛋白质表达检测，n=3。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，相对倍数改变（relativefoldchange）。
具体实施方式
[0025]以下结合附图对本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物墨水，其特征在于，包含主体材料、软骨脱细胞基质和外泌体，所述主体材料包含甲基丙烯酸酐明胶、氧化的透明质酸、多巴胺修饰的透明质酸。2.根据权利要求1所述的生物墨水，其特征在于，所述甲基丙烯酸酐明胶的质量比例为6%
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12%。3.根据权利要求1所述的生物墨水，其特征在于，所述氧化的透明质酸的质量比例为0.5%
‑
4%。4.根据权利要求1所述的生物墨水，其特征在于，所述多巴胺修饰的透明质酸的质量比例为0.5%
‑
4%。5.根据权利要求1所述的生物墨水，其特征在于，所述软骨脱细胞基质的质量比例为0.5
‑
5%。6.根据权利要求1所述的生物墨水，其特征在于，所述外泌体的浓度为10
ꢀ‑
1000μg/mL。7.根据权利要求1所述的生物墨水，其特征在于，还包含光引发剂，所述光引发剂的质量比例为0.1
‑
0.5%。8.根据权利要求1所述的生物墨水，其特征在于，包含质量比例6%
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：敖英芳，李琪，胡晓青，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，
类型：发明
国别省市：