一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法技术

本发明专利技术公开了一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法，属于检测样品处理技术领域，包括如下步骤：(1)将动物胃组织置于处理液中，振荡，制得混悬液一；(2)取混悬液一置于液体培养基中，振荡，制得混悬液二；混悬液二用于平板涂布。处理液组成如下：氯化钠45～114mM，氯化钾1.7～4.7mM，氯化钙0.4～1.1mM，无水硫酸镁0.2～0.7mM，磷酸氢二钠0.12～0.31mM，磷酸二氢钾0.1～0.4mM，碳酸氢钠180～301mM，溶剂为水。本发明专利技术用于评价动物胃内是否成功定植幽门螺杆菌，结果判定快速、简便、确切、稳定、可靠。

【技术实现步骤摘要】
一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法
本专利技术属于检测样品处理
，具体涉及一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法。
技术介绍
幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)位列于2017年世界卫生组织国际癌症研究机构公布的一类致癌物清单中，是由诺贝尔奖获得者罗宾.奥伦(J.RobinWarren)和巴利.马歇尔(BarryMarshall)在1983年从慢性胃炎和消化性溃疡患者的胃黏膜中分离培养获得。幽门螺杆菌属于螺杆菌科、螺杆菌属，呈弧形或螺旋形(亦有少数呈球形体)、单极、多鞭毛、末端钝圆，大小约为(2.5～4.0)μm×(0.5～1.0)μm，无荚膜、也无芽孢，革兰氏染色为阴性；其对生长条件十分苛刻，对环境氧、生长湿度、培养基等要求比较高。分离培养生长的幽门螺杆菌菌落形态似针尖样细小、圆形、灰白色略显透明、表面光滑湿润。目前人用幽门螺杆菌疫苗还未上市，其开发需要必不可少的动物模型支撑的临床前研究。幽门螺杆菌临床前研究动物模型主要集中在鼠胃模型，自幽门螺杆菌悉尼菌株(SydneyStrain1,SS1)在小鼠胃中成功定植以来，通过此模型来进行相关研究的报道已有很多。通常评价动物胃中幽门螺杆菌的定植情况是通过平板培养来实现的(微生物鉴定的金标准为分离培养)，目前动物胃中幽门螺杆菌的培养鉴定方法有：(1)将解剖好的胃组织用生理盐水或PBS洗涤，后将胃组织直接涂抹于平板上；(2)将解剖好的胃组织放入生理盐水或培养基中，采用匀浆器进行组织匀浆，后取匀浆液或对匀浆液进行稀释后进行涂平板。上述培养方法鉴定幽门螺杆菌存在漏检，且动物胃中杂菌多，在培养后的平板上不易通过肉眼直接鉴别出幽门螺杆菌；同时，由于杂菌的存在，易将杂菌鉴定为幽门螺杆菌。上述问题会造成动物胃中幽门螺杆菌定植情况鉴定结果呈假阴性或假阳性，不利于快速、确切评价是否定植成功幽门螺杆菌。因此，开发出简便、直观、稳定的检测动物胃中幽门螺杆菌的方法是进一步研究幽门螺杆菌相关药物的前提。
技术实现思路
本专利技术公开了一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法，可大大降低检测中杂菌的存活，使幽门螺杆菌定植结果判定更为确切、稳定。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种用于幽门螺杆菌培养检测前处理的处理液，该处理液组成如下：氯化钠45～114mM，氯化钾1.7～4.7mM，氯化钙0.4～1.1mM，无水硫酸镁0.2～0.7mM，磷酸氢二钠0.12～0.31mM，磷酸二氢钾0.1～0.4mM，碳酸氢钠180～301mM，溶剂为水。优选地，处理液组成如下：氯化钠102～108.8mM，氯化钾4～4.3mM，氯化钙0.9～1.0mM，无水硫酸镁0.6mM，磷酸氢二钠0.3mM，磷酸二氢钾0.3mM，碳酸氢钠181.7～226.2mM，溶剂为水。一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法，包括如下步骤：(1)将动物胃组织置于上述处理液中，振荡，制得混悬液一；(2)取混悬液一置于液体培养基中，振荡，制得混悬液二；所述混悬液二用于平板涂布。优选地，步骤(1)中每克动物胃组织所用处理液用量为0.9～1.7mL。优选地，步骤(1)中所述振荡为2000～6000r/min处理2～3min；步骤(2)中所述振荡为2000～6000r/min处理5～10s。进一步优选地，步骤(1)(2)中振荡速度为3000～3500r/min。优选地，步骤(2)中混悬液一与液体培养基体积比为1：(9-25)。优选地，动物包括Balb/c小鼠、C57小鼠、沙鼠或SD大鼠。优选地，取混悬液二10～200μL涂布于改良型Skirrow平板，在三气培养箱中培养3～7天；对改良型Skirrow平板培养结果进行菌落形态、快速尿素酶实验及快速革兰氏染色镜检鉴定实验，判定其定植是否成功，鉴定实验方法可参考文献(KaiY,Liu,FangC,Du,etal.Efficacyandpharmacologicalmechanismofpronase-enhancedlow-doseantibioticsforHelicobacterpylorieradication.Antimicrobialagentsandchemotherapy,2014,58(6):3348-3353)。综上所述，通过本专利技术方法对感染幽门螺杆菌的动物进行定植检测，可大大降低平板中杂菌的存活，使幽门螺杆菌平板培养近乎纯培养，降低根据培养平板鉴定幽门螺杆菌的难度，降低平板培养检测的假阳性或假阴性，使鉴定结果更确切、稳定，同时节约鉴定所需时间，有利于通过大批量动物进行幽门螺杆菌相关研究或药物开发，为直观、客观评价幽门螺杆菌定植提供了新的方法。附图说明图1所示为Balb/c小鼠胃幽门螺杆菌检测经前处理后平板培养结果；图2所示为编号2-1的Balb/c小鼠胃幽门螺杆菌检测经前处理后平板培养结果；图3所示为Balb/c小鼠胃幽门螺杆菌检测不经前处理平板培养结果；图4所示为编号4-1的Balb/c小鼠胃幽门螺杆菌检测不经前处理后平板培养结果；图5所示为蒙古沙鼠胃幽门螺杆菌检测经前处理后平板培养结果；图6所示为编号B-1的蒙古沙鼠胃幽门螺杆菌检测经前处理后平板培养结果；图7所示为蒙古沙鼠胃幽门螺杆菌检测不经前处理平板培养结果；图8所示为编号D-1的蒙古沙鼠胃幽门螺杆菌检测不经前处理后平板培养结果；图9所示为SD大鼠胃幽门螺杆菌检测经前处理后平板培养结果；图10所示为编号II-1的SD大鼠胃幽门螺杆菌检测经前处理后平板培养结果；图11所示为SD大鼠胃幽门螺杆菌检测不经前处理平板培养结果；图12所示为编号IV-1的SD大鼠胃幽门螺杆菌检测不经前处理后平板培养结果；图13所示为图2、4、6、8、10、12局部放大图。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。1.实验材料幽门螺杆菌悉尼菌株SS1由中国食品药品检定研究院提供，其余试剂及材料均为市售。改良型Skirrow液体培养基组成为氯化钠0.5％，胰蛋白胨0.25％，蛋白胨1.5％，酵母提取物0.5％，葡萄糖0.6％，胎牛血清12mL/100mL，万古霉素0.5mg/100mL，多粘菌素0.019mg/100mL，磺胺增效剂0.25mg/100mL，两性霉素B0.1mg/100mL。改良型Skirrow平板培养基组成为氯化钠0.5％，胰蛋白胨0.25％，蛋白胨1.5％，酵母提取物0.5％，琼脂粉1.75％，葡萄糖0.6％，脱纤维绵羊血5mL/100mL，万古霉素0.5mg/100mL，多粘菌素0.019mg/100mL，磺胺增效剂0.25mg/1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于幽门螺杆菌培养检测前处理的处理液，其特征在于，所述处理液组成如下：/n氯化钠45～114mM，氯化钾1.7～4.7mM，氯化钙0.4～1.1mM，无水硫酸镁0.2～0.7mM，磷酸氢二钠0.12～0.31mM，磷酸二氢钾0.1～0.4mM，碳酸氢钠180～301mM，溶剂为水。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于幽门螺杆菌培养检测前处理的处理液，其特征在于，所述处理液组成如下：
氯化钠45～114mM，氯化钾1.7～4.7mM，氯化钙0.4～1.1mM，无水硫酸镁0.2～0.7mM，磷酸氢二钠0.12～0.31mM，磷酸二氢钾0.1～0.4mM，碳酸氢钠180～301mM，溶剂为水。


2.一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将动物胃组织置于权利要求1所述处理液中，振荡，制得混悬液一；
(2)取混悬液一置于液体培养基中，振荡，制得混悬液二；所述混悬液二用于平板涂布。


3.根据权利要求2所述的一种幽门螺杆菌培养检测前处理方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜方川，童文德，朱白梅，童武学，周秋红，
申请(专利权)人：成都亿妙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51