一种SNP分型检测方法技术

本公开提供了SNP分型检测方法，包括：使待测DNA与基因芯片杂交，基因芯片上固定有5’端朝外的芯片探针，待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的序列与芯片探针5’端的序列反向互补，待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的第一个核苷酸与芯片探针5’端第一个核苷酸互补配对；加入随机引物或特异性引物、dNTP以及具有5’‑3’聚合酶活性和3’‑5’外切酶活性的酶进行反应，以获得与待测DNA中紧邻SNP位点下游3’方向的序列反向互补的序列1，序列1的3’端最后一个核苷酸与待测DNA中紧邻SNP位点下游3’方向的第一个核苷酸互补配对；加入DNA聚合酶和DNA连接酶，以及带有生物标记物的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP中的一种或多种；针对生物标记物对基因芯片进行检测，以确定SNP位点的基因型。

【技术实现步骤摘要】
一种SNP分型检测方法
本公开提供了一种SNP分型检测方法。
技术介绍
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，即DNA序列中单个碱基的差别。在自然界中，SNP广泛存在，对于SNP的检测分析在药物研制、临床检验和基因突变诊断等方面具有重要意义。目前的SNP检测方法大致可以分为两大类：一大类是基于凝胶电泳的传统经典的SNP检测方法，以单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、酶切扩增多态性序列、等位基因特异性PCR等为代表；另一大类是高通量、自动化程度较高的SNP检测方法，以直接测序、基因芯片、变性高效液相色谱、质谱检测技术、高分辨率溶解曲线等为代表。基因芯片技术是半导体工业技术里的微细加工技术和分子生物学的结合，在一个基片表面集成了大量密集排列的基因探针。利用基因芯片的SNP检测方法根据已知的SNP位点设计两种或者多种探针，将设计好的探针固定在特殊的载体上，基于杂交、引物延伸、连接等不同的方式实现对SNP位点的分型检测。该方法实现了快速、高效、并行的多态信息分析，是常用的一种高通量SNP分析方法。
技术实现思路
本公开可以提供一种SNP分型检测方法，所述方法包括以下步骤：(I)使待测DNA与基因芯片杂交，所述基因芯片上固定有5’端朝外的芯片探针，所述待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的序列与所述芯片探针5’端的序列反向互补，所述待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的第一个核苷酸与所述芯片探针5’端第一个核苷酸互补配对；(II)加入随机引物或特异性引物、dNTP以及具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性的酶进行反应，以获得与所述待测DNA中紧邻所述SNP位点下游3’方向的序列反向互补的序列1，所述序列1的3’端最后一个核苷酸与所述待测DNA中紧邻SNP位点下游3’方向的第一个核苷酸互补配对；(III)加入DNA聚合酶和DNA连接酶，以及带有生物标记物的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP中的一种或多种；(IV)针对所述生物标记物对基因芯片进行检测，以确定所述SNP位点的基因型。附图说明图1示出了：现有技术中通过经典连接法对A/C、A/G、T/C或T/G型的SNP进行分型的原理图，其中显色探针覆盖SNP位点，捕获探针未覆盖SNP位点，还单独示出了所使用的四种显色探针。图2示出了：现有技术中通过经典连接法对A/T或C/G型的SNP进行分型的原理图，其中捕获探针覆盖SNP位点，显色探针未覆盖SNP位点。图3示出了：根据本公开的SNP分型检测方法的原理图。图4示出了：在多种根据本公开的实施方式中，基因芯片的荧光扫描结果，其中4A对应于实施例1的结果，4B对应于实施例2的结果，4C对应于实施例3的结果，4D对应于实施例4的结果，4E对应于实施例5的结果，4F对应于实施例6的结果。具体实施方式原位合成基因芯片是基因芯片的一种，具有密集程度高、可合成任意序列的寡核苷酸等优点，特别适用于SNP分析等。在原位合成基因芯片上，连接法是检测SNP位点的经典方法。该方法通过两种探针实现对SNP位点的检测，第一种探针是固定在基因芯片上的捕获探针，其作用是把DNA片段固定到基因芯片表面；第二种探针是显色探针，其负责对基因芯片进行显色。对于A/C、A/G、T/C或T/G型的SNP，显色探针分成四组，针对SNP位点分别为A、C、G、T设计探针，其3’末端的第一个碱基是特异的，其中A和T用一种标记物标记，C和G用显示出不同颜色的另一种标记物标记；从第二个碱基到最后一个碱基都是简并的。捕获探针被设计为正好到SNP位点旁边的一个碱基，但并未覆盖SNP位点。在待测DNA与芯片杂交后，加入显色探针，利用连接酶的高保真性，与SNP位点互补配对的显色探针会被连接至捕获探针上。连接反应完成之后，去除游离的显色探针，进行染色和扫描，基于荧光的不同颜色来判定SNP位点的基因型。此类SNP分型方法的原理图可见图1。对于A/T或C/G型的SNP，捕获探针分为两组，其被设计为覆盖SNP位点；显色探针未覆盖SNP位点，仅有一种，呈现一种颜色。待测DNA与芯片杂交后，如果捕获探针与待测DNA完美匹配，那么加入显色探针后，再经过连接反应，显色探针会被连接至捕获探针上；如果捕获探针与待测DNA在SNP位点并不匹配，那么加入显色探针后，由于连接酶的高保真性，显色探针不会被连接至捕获探针上，从而在接下来的洗脱过程中会被洗掉。因此，进行染色和扫描后，可以基于荧光的有无来判定SNP位点的基因型。此种SNP分型方法的原理图可见图2。然而，在该方法中，原位合成基因芯片由于合成效率问题，存在探针质量落后和碱基不同步的问题，即从3’端向5’端合成的过程中，随着碱基数目增加，越靠近5’端，有效探针数量越少。对于A/C、A/G、T/C或T/G型的SNP，由于捕获探针检测的显色环节是通过具有特异碱基的简并探针连接实现，所以合成的不同步问题会造成5’端缺损的探针也参与显色反应，从而大幅增加检测的背景信号。同时，捕获探针中间不同步的碱基，在较低的杂交温度下也会产生非特异信号。此外，捕获探针的设计较为复杂，并且显色探针的成本较高。本专利技术的专利技术人创造性地设计了一种新的SNP分型检测方法，所述方法包括：使待测DNA与基因芯片杂交，所述基因芯片上固定有5’端朝外的芯片探针，所述待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的序列与所述芯片探针5’端的序列反向互补，所述待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的第一个核苷酸与所述芯片探针5’端第一个核苷酸互补配对；随后利用随机引物或特异性引物、dNTP以及具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性的酶进行反应，以获得与所述待测DNA中紧邻所述SNP位点下游3’方向的序列反向互补的序列1，所述序列1的3’端最后一个核苷酸与所述待测DNA中紧邻SNP位点下游3’方向的第一个核苷酸互补配对，也就是说，序列1和芯片探针之间间隔一个空碱基(无碱基)；之后利用高保真聚合酶填入荧光标记的dNTP或dUTP；最后针对所述生物标记物对基因芯片进行检测，以确定SNP位点的基因型。上述根据本公开的SNP分型检测方法的原理图可见图3。通过该方法，无需设计多种捕获探针和显色探针，但实现了特别有益的技术效果：不仅灵敏度高、精准高效，而且操作方便、简单快捷、成本较低。除非本文另有定义，否则本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。在本文中使用时，“待测DNA”指的是待检测其中SNP位点的DNA样本。在本文中使用时，“基因芯片”指的是通过在固相支持物上原位合成寡核苷酸探针或者直接将大量预先制备的探针固化于支持物表面而得到的芯片。通过将基因芯片与样品杂交，然后经过一系列的处理，最后利用芯片扫描仪和计算机对信号进行检测和分析，能够获得样品的遗传信息。在本文中使用时，“芯片探针”指的是通过原位合成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种SNP分型检测方法，所述方法包括以下步骤：/n(I)使待测DNA与基因芯片杂交，所述基因芯片上固定有5’端朝外的芯片探针，所述待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的序列与所述芯片探针5’端的序列反向互补，所述待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的第一个核苷酸与所述芯片探针5’端第一个核苷酸互补配对；/n(II)加入随机引物或特异性引物、dNTP以及具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性的酶进行反应，以获得与所述待测DNA中紧邻所述SNP位点下游3’方向的序列反向互补的序列1，所述序列1的3’端最后一个核苷酸与所述待测DNA中紧邻SNP位点下游3’方向的第一个核苷酸互补配对；/n(III)加入DNA聚合酶和DNA连接酶，以及带有生物标记物的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP中的一种或多种；/n(IV)针对所述生物标记物对基因芯片进行检测，以确定所述SNP位点的基因型。/n

【技术特征摘要】
1.一种SNP分型检测方法，所述方法包括以下步骤：
(I)使待测DNA与基因芯片杂交，所述基因芯片上固定有5’端朝外的芯片探针，所述待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的序列与所述芯片探针5’端的序列反向互补，所述待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的第一个核苷酸与所述芯片探针5’端第一个核苷酸互补配对；
(II)加入随机引物或特异性引物、dNTP以及具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性的酶进行反应，以获得与所述待测DNA中紧邻所述SNP位点下游3’方向的序列反向互补的序列1，所述序列1的3’端最后一个核苷酸与所述待测DNA中紧邻SNP位点下游3’方向的第一个核苷酸互补配对；
(III)加入DNA聚合酶和DNA连接酶，以及带有生物标记物的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP中的一种或多种；
(IV)针对所述生物标记物对基因芯片进行检测，以确定所述SNP位点的基因型。...

【专利技术属性】
技术研发人员：周巍，何沛中，丁巽，汪旭，徐皖星，
申请(专利权)人：生捷科技杭州有限公司，生捷科技嘉兴有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33