一种在基因芯片上形成交联倒置探针的方法技术

本发明专利技术提供了一种借助于跨链交叉连接在基因芯片上形成交联倒置探针的方法。本发明专利技术还涉及通过本发明专利技术的方法获得的带有交联倒置探针的基因芯片以及跨链交叉连接用于在基因芯片上形成交联倒置探针的用途。

【技术实现步骤摘要】
一种在基因芯片上形成交联倒置探针的方法
本专利技术提供了在基因芯片上形成交联倒置探针的方法及其用途，以及通过所述方法制得的基因芯片。
技术介绍
基因芯片技术是半导体工业技术里的微细加工技术和分子生物学的结合，在一个基片表面集成了大量密集排列的基因探针，通过检测每个探针的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，能够短时间内分析大量的基因，使人们迅速地读取和分析生物的基因信息。基因芯片技术不仅为人类基因组测序计划提前完成提供了重要手段，而且已经成为DNA测序和诊断系统的一个核心器件，它和DNA信息读取分析仪以及所得数据的分析软件一起组成了现代遗传学的信息系统和平台。基因芯片的制备方法多种多样，根据原理主要有三种：原位合成法、合成点样法和微珠芯片。原位合成法，包括原位光刻合成法和原位喷印合成法，都是把A、G、C、T四种碱基依次连接到基片的序列上，合成所需的寡核苷酸片段。Affymetrix、Centrillion和Agilent是全球最主要的原位合成芯片生产商，其中Affymetrix和Centrillion的原位合成芯片是通过原位光刻合成法生成的，而Agilent的原位合成芯片则是通过原位喷印合成法生成的。原位合成寡核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡核苷酸等优点，适用于DNA序列测定、SNP分析等；但通过原位合成法得到的芯片上的探针纯度不高，合成时会生成很多的无效/截短探针，而且通过光刻合成法得到的芯片上的探针的长度受到限制，通过喷印合成法得到的芯片上探针密度较低。此外，由于目前成熟的DNA合成技术都是从3’端向5’端合成，因此以上3家公司的基因芯片都是DNA探针5’端朝外，从而导致只能进行单一的杂交，不能直接进行延伸反应。合成点样法是利用点样仪将事先合成好的探针直接点在芯片上形成微阵列，探针和介质之间的连接主要是利用化学基团之间形成的化学键来完成。不同厂家生产的点样仪基本原理类似，只是点样的方式有所区别。由于探针事先通过成熟的化学方法制成，所以方法简单，容易实现，但是由于点样仪的限制，微阵列的探针个数和密度受到局限，难以实现大密度高通量基因芯片。微珠芯片是Illumina特有的基因芯片，其将合成完毕的探针通过其5’端连接到微珠上，再将微珠随机铺到芯片上，制得的是3’端朝外芯片，但是这种芯片只能达到中等探针密度。而且由于微珠的随机分布，所以Illumina每片芯片出厂都得先解码和质控，这也增加了其制作成本。现有的通过光刻合成法生成的原位合成基因芯片具有高密度，但其上的探针长度受到限制，无效探针较多，且探针均为5’端朝外，只能进行单一的杂交检测，需要复杂的样品前处理步骤才能上芯片进行最后的测试。现有的通过合成点样法制得的基因芯片以及Illumina的微珠芯片，虽然是3’端朝外芯片，但只能达到低或中等探针密度，无法实现高通量检测。因此，本专利技术所要解决的技术问题是克服现有的基因芯片无法同时实现探针3’端朝外和探针密度高的性能，提供一种3’端朝外的高密度基因芯片，以实现更高通量的检测，简化处理程序。跨链交叉连接(又称为“链间交联”；interstrandcross-link，ICL)是异常生物活性的DNA损伤。内源性产生基因组DNA的跨链交叉连接可能导致衰老、神经退行性病变和癌症等重大疾病。导致DNA跨链交叉连接损伤的因素有很多，如体内代谢过程中产生的自由基和其它活泼中间体，环境中的紫外线和离子辐射，一些内源和外源化学物质等。其中，亲电烷化剂作为一类重要的化学物质在细胞体内可以分解成活泼的离子，这些离子能够与一条DNA链上的碱基发生烷化反应形成活泼中间体，进而与另一DNA链发生烷化反应，最终在细胞中形成DNA跨链交叉连接。DNA跨链交叉连接能阻止DNA链的分离，完全阻断DNA的复制或转录，若不能及时被修复，DNA跨链交叉连接的最终结果是细胞死亡。多种致癌物质和临床应用的抗癌药物都能够导致DNA跨链交叉连接损伤。环境中、食品中广泛存在的亚硝胺类化合物经过代谢活化后均能够生成烷基正离子与DNA碱基发生反应，导致DNA跨链交叉连接损伤并最终诱发癌症。临床上常用的烷化剂类抗癌药物也是通过导致癌细胞DNA跨链交叉连接损伤而发挥抗癌作用，如用于治疗脑瘤、白血病等的亚硝基脲类烷化剂、用于治疗恶性淋巴瘤等的氮芥类烷化剂等。然而，现有技术中尚未公开或暗示在测序领域中利用人为产生的跨链交叉连接的构思或技术启示。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人对现有技术中已知的基因芯片进行了大量理论分析和实验研究，创造性地想到了对基因芯片表面的探针进行改造，借助于跨链交叉连接在基因芯片上形成3’端朝外的探针。所述探针通过化学交联而非杂交固定在固相支持物上，并且由于3’端朝外而可以方便地直接进行链的延伸反应，从而使得能够大大提升有效探针的浓度，简化芯片的后续处理，更广泛地适用于芯片表面的原位化学反应，拓宽原位合成基因芯片的使用范围，使提取得到的基因组不用经过复杂的前处理步骤就能上芯片进行反应，具有更高的灵敏度和更低的检测限。因此，本专利技术创造性地将跨链交叉连接应用于测序领域，在基因芯片上形成3’端朝外的探针。所述探针通过化学交联而非杂交固定在固相支持物上，能实现解决了人们长久以来一直想要克服的传统基因芯片在探针长度、无法进行延伸反应等方面的缺陷。在第一方面，本专利技术提供了一种借助于跨链交叉连接在基因芯片上形成交联倒置探针的方法，所述方法包括以下步骤：a)在所述基因芯片上的探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，b)任选地，进行洗涤，c)使合成探针与所述U-芯片探针杂交，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，d)任选地，进行洗涤，e)加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，f)任选地，进行洗涤，g)加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，h)任选地，进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。在另一方面，本专利技术提供了通过本专利技术所述的方法获得的带有交联倒置探针的基因芯片。本专利技术还涉及一种带有交联倒置探针的基因芯片，其中直接固定在所述基因芯片上的芯片探针与并未直接固定在所述基因芯片上的合成探针在一对碱基位点处具有跨链交叉连接点，所述跨链交叉连接点是所述基因芯片上的芯片探针的5’方向终点，所述合成探针中位于所述跨链交叉连接点的上游5’方向的序列与所述基因芯片上的芯片探针中紧邻所述跨链交叉连接点的下游3’方向序列反向互补。本专利技术还涉及跨链交叉连接用于在基因芯片上形成交联倒置探针的用途。附图说明图1示出了利用aoNao交联制备3’端朝外芯片的原理。其中，在芯片探针5’端合成U碱基，使合成探针与其杂交，该合成探针的组成包括与芯片探针反向互本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种借助于跨链交叉连接在基因芯片上形成交联倒置探针的方法，所述方法包括以下步骤：/na)在所述基因芯片上的探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，/nb)任选地，进行洗涤，/nc)使合成探针与所述U-芯片探针杂交，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，/nd)任选地，进行洗涤，/ne)加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，/nf)任选地，进行洗涤，/ng)加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，/nh)任选地，进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，/n从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种借助于跨链交叉连接在基因芯片上形成交联倒置探针的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在所述基因芯片上的探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，
b)任选地，进行洗涤，
c)使合成探针与所述U-芯片探针杂交，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，
d)任选地，进行洗涤，
e)加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，
f)任选地，进行洗涤，
g)加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，
h)任选地，进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，
从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述用于跨链交叉连接的交联剂选自aoNao、二胺类。


3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤c)在所述步骤e)之前或之后进行。


4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤c)和所述步骤g)同时进行。

【专利技术属性】
技术研发人员：周巍，何沛中，戴小军，简俊涛，
申请(专利权)人：生捷科技杭州有限公司，生捷科技嘉兴有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33