一种SNP分型检测方法技术

本发明专利技术提供了一种利用基因芯片锚定RCA技术来进行SNP分型检测的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种SNP分型检测方法
本专利技术提供了一种SNP分型检测方法。
技术介绍
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，即DNA序列中单个碱基的差别。在自然界中，SNP广泛存在，对于SNP的检测分析在药物研制、临床检验和基因突变诊断等方面具有重要意义。目前的SNP检测方法大致可以分为两大类：一大类是基于凝胶电泳的传统经典的SNP检测方法，以单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、酶切扩增多态性序列、等位基因特异性PCR等为代表；另一大类是高通量、自动化程度较高的SNP检测方法，以直接测序、基因芯片、变性高效液相色谱、质谱检测技术、高分辨率溶解曲线等为代表。基因芯片技术是半导体工业技术里的微细加工技术和分子生物学的结合，在一个基片表面集成了大量密集排列的基因探针。现有技术中绝大多数基因芯片上的探针均为5’端朝外；少量基因芯片上的探针3’端朝外，但这种芯片只能达到中等探针密度，而且制作成本较高。利用基因芯片的SNP检测方法根据已知的SNP位点设计两种或者多种探针，将设计好的探针固定在特殊的载体上，基于杂交、引物延伸、连接等不同的方式实现对SNP位点的分型检测。该方法实现了快速、高效、并行的多态信息分析，是常用的一种高通量SNP分析方法。经典的连接法检测SNP涉及将DNA样本在扩增后与基因芯片上5’端朝外的探针杂交，通过碱基配对和DNA连接酶的特异性实现对待测碱基的检测，但该方法的不足之处在于检测灵敏度有限。滚环扩增(rollingcircleamplification,RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。在RCA中，一个DNA环、一个短的DNA引物(与该环的一部分互补)和酶催化剂将dNTPs转化为一个由数千个该环的标准重复拷贝组成的单链共链DNA分子。这种方法不仅可以直接扩增DNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。与其他扩增程序不同，RCA产生一个单独的扩增产物，它仍然与DNA引物相连。因此，RCA非常适合于固相格式，例如在特定芯片位置生成局部信号的基因芯片。此外，RCA的这一独特特性允许在不受干扰的情况下同时(多次)进行许多分析，因此赋予了基因芯片上的SNP检测以高特异性。与经典的连接法检测SNP相比，利用RCA技术在基因芯片上进行SNP检测可以通过信号扩大的方式提高SNP分型检测的灵敏度。目前，利用RCA技术进行SNP检测的方法中大多需要用到锁式探针，即首先通过连接反应环化与模板链杂交的探针，再扩增已环化的探针，然后检测扩增信号。虽然利用RCA技术进行SNP检测能够克服经典的连接法检测SNP中检测灵敏度有限的缺陷，但其自身仍然存在一定的不足。一是锁式探针的设计复杂，由于该方法需要使用特殊的锁式探针，而每个SNP位点都需要设计特定的锁式探针，因此整个过程繁琐且耗时。二是锁式探针的成本问题，由于锁式探针目前主要的获得方式是直接合成，而其通常具有接近100bp的长度，因此合成费用较高。三是信号检测时的背景问题，RCA过程中未成环的锁式探针和未结合探针的模板DNA可能产生一些背景信号。Nallur,G.(2001).SignalamplificationbyrollingcircleamplificationonDNAmicroarrays.NucleicAcidsResearch,29(23),118e–118.doi:10.1093/nar/29.23.e118公开了一种新的结合RCA技术的连接法检测SNP，其中虽然避免了锁式探针的使用，但需要使用多种P2探针和多种环状模板；此外，由于P2探针是特殊合成的两端都是3’的探针，合成成本极高。因此，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种新的SNP检测方法，其能够实现高通量、高灵敏度、高特异性，同时简化检测程序，降低所使用的探针的成本。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人对现有技术中已知的SNP检测方法和基因芯片进行了大量理论分析和实验研究，创造性地想到了对基因芯片表面的探针进行特殊设计，巧妙构思了一种新的SNP检测方法。本专利技术的方法使用具有朝外3’端的交联倒置探针的基因芯片，利用RCA技术来进行信号放大，避免使用成本高昂的锁式探针和特殊合成的两端都是3’的探针。本专利技术的具有交联倒置探针的基因芯片具有更高的探针密度，能够实现更高通量的检测。另外，本专利技术的方法只需合成特异性的合成探针与连接探针，二者均为普通的单链核苷酸探针；使用的RCA环状模板是通用模板而非特异性RCA环状模板，从而实现了高通量、高灵敏度、高特异性，同时简化了检测程序，降低了检测成本，提高了检测效率。本专利技术提供了一种利用基因芯片锚定RCA技术来进行SNP分型检测的方法，所述基因芯片上固定有交联倒置探针，其中直接固定在所述基因芯片上的芯片探针与并未直接固定在所述基因芯片上的合成探针在一对碱基位点处具有跨链交叉连接点，所述跨链交叉连接点是所述芯片探针的5’方向终点，所述合成探针中位于所述跨链交叉连接点的上游5’方向的序列与所述芯片探针中紧邻所述跨链交叉连接点的下游3’方向序列反向互补；所述方法包括以下步骤：(I)目标DNA与合成探针杂交，其中所述合成探针的3’端与所述目标DNA中紧邻待测SNP位点下游3’方向的序列反向互补，并且所述合成探针的3’端最后一个核苷酸与所述目标DNA中的SNP位点互补配对；(II)连接探针与目标DNA杂交，其中所述连接探针的5’端与所述目标DNA中紧邻待测SNP位点上游5’方向的序列反向互补；(III)加入连接酶，连接所述合成探针的3’端终点与所述连接探针的5’端终点；(IV)任选地，用碱性溶液进行洗涤；(V)加入环状模板，其中所述环状模板的一部分与所述连接探针的3’端反向互补，以进行RCA反应；(VI)对RCA反应结果进行检测，以确定所述SNP位点的基因型。本专利技术方法中使用的基因芯片可通过以下步骤制备：a)在芯片探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，b)任选地，进行洗涤，c)使合成探针与所述U-芯片探针杂交，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，d)任选地，进行洗涤，e)加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，f)任选地，进行洗涤，g)加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，h)任选地，进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。本专利技术还涉及带有交联倒置探针的基因芯片用于SNP分型检测的用途，其中直接固定在所述基因芯片上的芯片探针与并未直接固定在所述基因芯片上的合成探针在一对碱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用基因芯片锚定RCA技术来进行SNP分型检测的方法，所述基因芯片上固定有交联倒置探针，其中直接固定在所述基因芯片上的芯片探针与并未直接固定在所述基因芯片上的合成探针在一对碱基位点处具有跨链交叉连接点，所述跨链交叉连接点是所述芯片探针的5’方向终点，所述合成探针中位于所述跨链交叉连接点的上游5’方向的序列与所述芯片探针中紧邻所述跨链交叉连接点的下游3’方向序列反向互补；/n所述方法包括以下步骤：/n(I)目标DNA与合成探针杂交，其中所述合成探针的3’端与所述目标DNA中紧邻待测SNP位点下游3’方向的序列反向互补，并且所述合成探针的3’端最后一个核苷酸与所述目标DNA中的SNP位点互补配对；/n(II)连接探针与目标DNA杂交，其中所述连接探针的5’端与所述目标DNA中紧邻待测SNP位点上游5’方向的序列反向互补；/n(III)加入连接酶，连接所述合成探针的3’端终点与所述连接探针的5’端终点；/n(IV)任选地，用碱性溶液进行洗涤；/n(V)加入环状模板，其中所述环状模板的一部分与所述连接探针的3’端反向互补，以进行RCA反应；/n(VI)对RCA反应结果进行检测，以确定所述SNP位点的基因型。/n...

【技术特征摘要】
1.一种利用基因芯片锚定RCA技术来进行SNP分型检测的方法，所述基因芯片上固定有交联倒置探针，其中直接固定在所述基因芯片上的芯片探针与并未直接固定在所述基因芯片上的合成探针在一对碱基位点处具有跨链交叉连接点，所述跨链交叉连接点是所述芯片探针的5’方向终点，所述合成探针中位于所述跨链交叉连接点的上游5’方向的序列与所述芯片探针中紧邻所述跨链交叉连接点的下游3’方向序列反向互补；
所述方法包括以下步骤：
(I)目标DNA与合成探针杂交，其中所述合成探针的3’端与所述目标DNA中紧邻待测SNP位点下游3’方向的序列反向互补，并且所述合成探针的3’端最后一个核苷酸与所述目标DNA中的SNP位点互补配对；
(II)连接探针与目标DNA杂交，其中所述连接探针的5’端与所述目标DNA中紧邻待测SNP位点上游5’方向的序列反向互补；
(III)加入连接酶，连接所述合成探针的3’端终点与所述连接探针的5’端终点；
(IV)任选地，用碱性溶液进行洗涤；
(V)加入环状模板，其中所述环状模板的一部分与所述连接探针的3’端反向互补，以进行RCA反应；
(VI)对RCA反应结果进行检测，以确定所述SNP位点的基因型。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤(I)在所述步骤(II)之前或之后进行，或二者同时进行。


3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤(III)中的连接酶是AMP连接酶、HiFiTaqDNA连接酶或Ecoli连接酶。


4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述芯片探针与所述合成探针之间的反向互补序列的长度为5-30个碱基、10-25个碱基或15-25个碱基。


5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述合成探针与所述目标DNA之间的反向互补序列的长度为20个碱基或更多个碱基，25个碱基或更多个碱基，或者30个碱基或更多个碱基。


6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述连接探针与所述目标DNA之间的反向互补序列的长度为9个碱基或更多个碱基，11个碱基或更多个碱基，或者13个碱基或更多个碱基。


7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：周巍，何沛中，戴小军，简俊涛，
申请(专利权)人：生捷科技杭州有限公司，生捷科技嘉兴有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33