一种NTRK融合突变检测的探针组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种NTRK融合突变检测的探针组，该探针组包括核苷酸序列如SeqID NO.1～146所示的一个或多个探针。本发明专利技术还公开了一种NTRK融合突变检测的试剂盒，该试剂盒包括所述的探针组。本发明专利技术更进一步提供了一种利用所述探针组进行NTRK融合突变检测的方法。利用本发明专利技术设计的探针组进行NTRK融合突变检测的方法缩短了杂交时间，可以更加快速地检测非小细胞肺癌患者NTRK基因是否发生融合突变，与检测金标准FISH法相比，具有检测灵敏度高、覆盖面广、通量高等优点，有利于大规模临床开展。

A probe group, kit and method for ntrk fusion mutation detection

【技术实现步骤摘要】
一种NTRK融合突变检测的探针组、试剂盒及方法
本专利技术属于基因检测
，特别涉及一种NTRK融合突变检测的探针组、试剂盒及方法。
技术介绍
NTRK(NeuroTrophinReceptorKinase)是神经营养因子受体络氨酸激酶。原肌球蛋白受体激酶(TRK)家族包括TRKA、TRKB和TRKC三种蛋白，它们分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3基因编码，这些蛋白通常在神经组织中表达。NTRK基因的融合突变促进了肿瘤的形成。TRK途径的失调可导致神经发育障碍和各种中枢神经系统(CNS)疾病，但当NTRK基因与不相关的基因融合时也会诱导癌症发生。据世界卫生组织估计，有0.2％的NSCLC患者存在NTRK融合。TRK融合蛋白将处于持续活跃状态，引发永久性的信号级联反应，驱动TRK融合肿瘤的扩散和生长。因此，NTRK融合蛋白充当致癌驱动因子，促进癌细胞生长和存活。这一发现导致了NTRK基因融合作为癌症治疗的新靶点而出现。我们在检测NTRK融合的时候，还需要检测其耐药的位点突变。拉罗替尼(Larotrectinib)是一款不分年龄和癌种类型针对NTRK融合的广谱TRK抑制剂，主要抑制酪氨酸激酶的活性。TRK家族蛋白是酪氨酸激酶，如果能抑制激酶活性，就能抑制癌症生长。还有针对其耐药位点的第二代TRK靶向药物LOXO-195已经出炉，专门来对抗耐药的新突变。目前，有多种方法可用于检测NTRK基因融合突变，包括FISH、RT-PCR和NGS检测。其中，RT-PCR法只可检测已知突变，且由于NTRK融合断点具有多变性，极大可能发生漏检。再者，对于FISH法来说，一组FISH分离探针通常只用于一种基因的融合突变检测，较为单一，缺乏全面性，难以大范围的开展。基于此，有必要提供一种覆盖面广、准确性高、敏感性高且便于开展的NTRK突变检测方案。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种NTRK融合突变检测的探针组、试剂盒及方法；利用该探针组的检测方法覆盖面广，准确性高，敏感性高且便于开展。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现：一种NTRK融合突变检测的探针组，包括核苷酸序列如SeqIDNO.1～146所示的一个或多个探针。进一步的，上述探针组包括核苷酸序列如SeqIDNO.1～146所示的全部探针。进一步的，该探针组中的探针序列的5’端具有标记物。本专利技术还提供了一种NTRK融合突变检测的试剂盒，该试剂盒包括上述探针组。此外，本专利技术还提供了一种NTRK融合突变检测的方法，包括以下步骤：(1)提取待检测样本的DNA；(2)利用步骤(1)提取的DNA构建待检测样本的DNA文库；(3)获得检测NTRK融合突变的探针组；(4)使步骤(3)获得的探针组与步骤(2)构建的DNA文库进行杂交，以捕获目标区域的DNA序列；(5)对步骤(4)获得的杂交产物进行洗脱、分离，对捕获的目标区域的DNA序列进行PCR扩增，获得扩增产物，对扩增产物进行纯化，得到测序文库，然后对测序文库进行质检；(6)利用高通量测序方法对步骤(5)获得的测序文库进行检测。进一步的，上述步骤(5)获得的测序文库的DNA片段长度为350-450bp。更进一步的，步骤(2)中，首先将提取的DNA片段化，然后利用该片段化的DNA构建DNA文库。上述步骤(5)中，利用探针上的标记物对杂交产物进行分离。进一步的，探针上的标记物为生物素，具体的，步骤(5)是利用链霉亲和素和生物素的亲和作用对杂交产物进行分离。本专利技术的有益效果是：(1)利用本专利技术设计的探针组进行NTRK融合突变检测的方法缩短了杂交时间，可以更加快速地检测非小细胞肺癌患者NTRK基因是否发生融合突变，与检测金标准FISH法相比，具有检测灵敏度高、覆盖面广、通量高等优点，有利于大规模临床开展。(2)本专利技术通过NGS技术对NTRK基因融合突变进行全面检测，可以一次性检测患者存在的所有类型的突变，通过对基因进行靶向测序，可以发现何段未知基因序列和其他基因发生融合突变，且可以检测到耐药突变，从而可以在分子水平得到非常确凿的证据，与传统的Fish杂交相比，证据更明确与直接，不需要人工的主观经验判断；NTRK基因融合突变是决定患者是否采用拉罗替尼进行治疗的有效指标；而且临床标本检测中是否存在NTRK基因融合突变，可为临床医生选择药物提供参考，做到进一步降低治疗风险，提高患者的生存质量。附图说明图1为本专利技术实施例的探针组与对比探针组在检测时的覆盖率对比结果。图2为本专利技术实施例中待测样本1的测序文库的质检结果图。图3为本专利技术实施例中待测样本2的测序文库的质检结果图。图4为本专利技术实施例中待测样本3的测序文库的质检结果图。图5为本专利技术实施例中待测样本4的测序文库的质检结果图。图6为本专利技术实施例中待测样本5的测序文库的质检结果图。图7为本专利技术实施例中待测样本6的测序文库的质检结果图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的较佳实施例进行详细阐述，以使本专利技术的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本专利技术的保护范围做出更为清楚明确的界定。实施例该实施例的样本来源为6例主诉为非小细胞肺癌患者的血液样品(患者均已签署知情同意书)，以下为6名患者的基因检测过程。一、DNA的提取全血样品使用QIAampTMDNAMiniKit(Qiagen.Cat.no.51304)试剂盒提取患者的核酸样品。具体的提取过程为:1.吸取20μLQIAGENProtease(蛋白酶K100mg/mL)加入至无菌2mL离心管底部；2.将200μL全血样品加入到上述离心管内，然后加入4μLRNaseA(核糖核酸酶A100mg/mL)，吹打混匀，室温孵育5分钟，再加入200μL的BufferAL(裂解缓冲液)，涡旋混匀15秒；3.将离心管置于56℃水浴锅中孵育10分钟；4.瞬时离心，加入200μL乙醇(96-100％)，涡旋混匀15秒，得到样品溶液；5.转移样品溶液到QIAampMinispincolumn(分离柱)中，室温放置1分钟，8000rpm离心1分钟；6.将QIAampMinispincolumn放在一个干净的2mL收集管中，丢弃装有滤液的管子；7.加入500μLbufferAW1(洗涤缓冲液1)，8000rpm离心1分钟；8.弃滤液，向QIAampMinispincolumn中加入500μLbufferAW2(洗涤缓冲液2)，20000rpm离心3分钟；9.弃滤液，向QIAampMinispincolumn的滤膜中心加入60μL56℃水浴预热的BufferAE(溶解缓冲液)，室温孵育5min，8000rpm离心1分钟；10.收集洗脱液，在装有洗脱液的1.5mL离心管本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NTRK融合突变检测的探针组，其特征在于，包括核苷酸序列如Seq ID NO.1～146所示的一个或多个探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种NTRK融合突变检测的探针组，其特征在于，包括核苷酸序列如SeqIDNO.1～146所示的一个或多个探针。


2.根据权利要求1所述的NTRK融合突变检测的探针组，其特征在于，包括核苷酸序列如SeqIDNO.1～146所示的全部探针。


3.根据权利要求1所述的NTRK融合突变检测的探针组，其特征在于，该探针组中的探针序列的5’端具有标记物。


4.一种NTRK融合突变检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所述的探针组。


5.一种NTRK融合突变检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检测样本的DNA；
(2)利用步骤(1)提取的DNA构建待检测样本的DNA文库；
(3)获得检测NTRK融合突变的探针组；
(4)使步骤(3)获得的探针组与步骤(2)构建的DNA文库进行杂交，以捕获目标区域的DNA序列；
(5)对步骤(4...

【专利技术属性】
技术研发人员：张惠丹，戴敬，刘琦，赵洪玉，
申请(专利权)人：苏州璞瑞卓越生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32