一种单核细胞增生李斯特氏菌的多位点基因分型方法技术

本发明专利技术涉及单核细胞增生李斯特氏菌检测技术领域，具体涉及一种单核细胞增生李斯特氏菌的多位点基因分型方法。本发明专利技术提供与单核细胞增生李斯特氏菌基因分型相关的7个SNP位点，利用这7个SNP位点的组合可以较为准确地进行单增李斯特菌的基因分型，对于单增李斯特菌的种间区分度较高，并且分型结果与传统的MLST分型结果可相互对应。本发明专利技术提供的多重PCR‑反向线点杂交对单增李斯特菌进行基因分型的方法能够实现高效快速的单增李斯特菌的基因分型，大大提高了单增李斯特菌检测和分型的工作效率。

A multi site genotyping method for Listeria monocytogenes

【技术实现步骤摘要】
一种单核细胞增生李斯特氏菌的多位点基因分型方法
本专利技术涉及单核细胞增生李斯特氏菌检测
，具体涉及与单增李斯特菌基因分型相关的SNP位点，检测该SNP位点的特异性引物和探针，以及利用多重PCR-反向线点杂交快速进行单增李斯特菌多位点基因分型的方法。
技术介绍
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，简称单增李斯特菌)是一种人畜共患病的病原菌。单增李斯特菌作为一种食源性病原菌，可引起发热性胃肠炎、孕妇流产、死产及严重的弥散性感染(如败血症、脑膜炎等疾病)。人群中的李斯特菌病主要是由于摄入污染单增李斯特菌的食物引起的，其发病率相对较低，但该病在免疫缺陷者、老人、孕妇、新生儿等人群中致死率较高，可达20％～30％。研究表明，细菌的ST型与其致病性具有一定的相关性，许多致病菌的强毒株都集中于某几个ST型或克隆群。单增李斯特菌的ST9型、ST8型、ST87型、ST122型4种ST型别的菌株占食品来源菌株总数的一半以上，是食品来源单增李斯特菌的优势型别。通过分析单增李斯特菌毒力基因的位点多态性，快速确定单增李斯特菌菌株的基因分型，能够大大提高临床和食品检测的工作效率，因此具有重要意义。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供与单增李斯特菌基因分型相关的SNP位点，检测该SNP位点的特异性引物和探针，以及利用多重PCR-反向线点杂交快速进行单增李斯特菌多位点基因分型的方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术通过对从食品中分离得到的264株单增李斯特菌进行全基因组测序分析，发现在单增李斯特菌基因组的多个位点存在单核苷酸多态性(SNP)。利用软件分析进行SNP位点的初步筛选；对于初步筛选得到的SNP位点的上下游序列的突变情况进行分析并结合各SNP位点在菌株之间的区分度进行进一步筛选；对进一步筛选得到的SNP位点进行不同单增李斯特菌的分离菌株间的区分度和遗传稳定性进行验证，保留具有较高的种间区分度和遗传稳定性的SNP位点。最终发现在单增李斯特毒力基因hly中存在7个能使蛋白质发生变异的、区分度较高且遗传稳定的SNP位点，这些SNP位点与单增李斯特菌的ST分型存在一定的对应关系，可以用于单增李斯特菌种以下水平的分型。hly基因编码的LLO蛋白是一种由529个氨基酸组成的具有溶血活性的成孔蛋白，属于胆固醇依赖性溶血素家族成员。LLO蛋白对于单增李斯特菌从初级或次级噬菌体中逃逸，以及在宿主细胞质中的繁殖过程都起到重要作用，是单增李斯特菌最重要的毒力因子之一。本专利技术进一步针对上述筛选得到的7个SNP位点设计了检测引物和探针，并在此基础上开发了检测上述SNP位点的多次PCR-反向线点杂交方法。具体地，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供与单核细胞增生李斯特氏菌基因分型相关的SNP位点，所述SNP位点包含位于如SEQIDNO.1所示序列的如下SNP位点中的一个或多个：(1)第91位，A/C；(2)第104位，C/T；(3)第1153位，A/G；(4)第1312位，G/A；(5)第1362位，C/G；(6)第1568位，A/G；(7)第1569位，A/T。如SEQIDNO.1所示的序列为单增李斯特菌hly基因的核苷酸序列，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。上述SNP位点的位置参考序列CP025567基因组的205468-207057。上述7个SNP位点对应hly基因编码蛋白的6个氨基酸位点差异，分别为第31位N/H，第35位S/L，第385位I/V，第438位V/I，第454位S/R和第523位K/S。在进行单增李斯特菌的基因分型时，可采用上述7个SNP位点中的任意一个或多个SNP位点的组合。采用上述7个SNP位点的组合进行单增李斯特菌的基因分型能够获得更准确的基因分型结果。本专利技术通过利用上述7个SNP位点的组合对从食品中分离得到的264株单增李斯特菌进行基因分型，证明该分型方法具有较高的种间区分度和准确性，且分型结果能够与MLST分型结果相互对应。第二方面，本专利技术提供用于检测上述SNP位点的特异性引物。具体地，用于检测上述SNP位点的特异性引物包含序列如SEQIDNO.3-4所示的引物、序列如SEQIDNO.5-6所示的引物或序列如SEQIDNO.3-4所示的引物与序列如SEQIDNO.5-6所示的引物的组合。其中，序列如SEQIDNO.3-4所示的引物可用于检测上述(1)、(2)的SNP位点。序列如SEQIDNO.5-6所示的引物可用于检测上述(3)～(7)中的SNP位点。第三方面，本专利技术提供用于检测所述SNP位点的探针。具体地，用于检测所述SNP位点的探针包含序列如SEQIDNO.7-18所示的探针中的一个或多个。其中，序列如SEQIDNO.7-8所示的探针用于检测上述(1)中的SNP位点；序列如SEQIDNO.9-10所示的探针用于检测上述(2)中的SNP位点；序列如SEQIDNO.11-12所示的探针用于检测上述(3)中的SNP位点；序列如SEQIDNO.13-14所示的探针用于检测上述(4)中的SNP位点；序列如SEQIDNO.15-16所示的探针用于检测上述(5)中的SNP位点；序列如SEQIDNO.17-18所示的探针用于检测上述(6)、(7)中的SNP位点。上述特异性引物和探针可组合为引物探针组合，配合使用进行所述SNP位点的检测。上述特异性引物和探针可用于采用多重PCR-反向线点杂交(mPCR-RLB)检测方法，在用于该方法检测时，上述特异性引物的5’端可采用生物素等标记，上述探针的5’端可采用氨基的基团标记。第四方面，本专利技术提供用于单核细胞增生李斯特氏菌基因分型或检测的试剂盒，其包含用于检测所述SNP位点的特异性引物和/或探针。优选地，所述试剂盒还包含PCR反应缓冲液、dNTP、DNA聚合酶等。第五方面，本专利技术提供所述SNP位点或用于检测所述SNP位点的特异性引物或用于检测所述SNP位点的探针或所述试剂盒在单核细胞增生李斯特氏菌基因分型中的应用。第六方面，本专利技术提供所述SNP位点或用于检测所述SNP位点的特异性引物或用于检测所述SNP位点的探针或所述试剂盒在单核细胞增生李斯特氏菌检测中的应用。第七方面，本专利技术提供所述SNP位点或用于检测所述SNP位点的特异性引物或用于检测所述SNP位点的探针或所述试剂盒在单核细胞增生李斯特氏菌毒力鉴定或耐药性鉴定中的应用。第八方面，本专利技术提供一种单核细胞增生李斯特氏菌的基因分型方法，其为利用多重PCR-反向线点杂交方法检测待测单核细胞增生李斯特氏菌中所述SNP位点的多态性，根据SNP位点的多态性对单核细胞增生李斯特氏菌进行基因分型。具体地，所述利用多重PCR-反向线点杂交方法检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法包括如下步骤：(1)多重PCR：以待测单核细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.与单核细胞增生李斯特氏菌基因分型相关的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点包含位于如SEQ ID NO.1所示序列的如下SNP位点中的一个或多个：/n(1)第91位，A/C；/n(2)第104位，C/T；/n(3)第1153位，A/G；/n(4)第1312位，G/A；/n(5)第1362位，C/G；/n(6)第1568位，A/G；/n(7)第1569位，A/T。/n

【技术特征摘要】
1.与单核细胞增生李斯特氏菌基因分型相关的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点包含位于如SEQIDNO.1所示序列的如下SNP位点中的一个或多个：
(1)第91位，A/C；
(2)第104位，C/T；
(3)第1153位，A/G；
(4)第1312位，G/A；
(5)第1362位，C/G；
(6)第1568位，A/G；
(7)第1569位，A/T。


2.用于检测权利要求1所述的SNP位点的特异性引物，其特征在于，其包含序列如SEQIDNO.3-4所示的引物，和/或，序列如SEQIDNO.5-6所示的引物。


3.用于检测权利要求1所述的SNP位点的特异性探针，其特征在于，其包含序列如SEQIDNO.7-18所示的特异性探针中的一个或多个。


4.用于单核细胞增生李斯特氏菌基因分型或检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的特异性引物和/或权利要求3所述的特异性探针。


5.权利要求1所述的SNP位点或权利要求2所述的特异性引物或权利要求3所述的特异性探针或权利要求4所述的试剂盒在单核细胞增生李斯特氏菌基因分型中的应用。


6.权利要求1所述的SNP位点或权利要求2所述的特异性引物或权利要求3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛晨玉，刘翟，袁静，李伟，闫超，王丹，汪启，李南南，宋丽萍，
申请(专利权)人：北京市食品安全监控和风险评估中心北京市食品检验所，中国科学院微生物研究所，首都儿科研究所，中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11