一种3D DNA行走机器耦合催化发夹自组装的microRNA生物传感器制造技术

在本专利中，我们提出了一种新的、熵驱动的三维DNA步行机器，它结合了催化发夹组装反应(CHA)成功的用于检测microRNA。此步行机器使用了链霉亲合素包裹的聚苯乙烯微球作为3‑D轨道基质，以保证良好的重复性。其制备方法是将miRNA‑21作为一个靶目标，通过熵驱动链置换反应不断地在DNA功能化的聚苯乙烯微球轨道上行走，导致聚苯乙烯微球上DNA三核酸复合底物的分解，从而实现miRNA 21的循环。此外，从DNA三核酸复合底物中释放大量辅助链可以催化CHA反应并伴随着获得荧光信号的增加。这种复合生物传感器的线性范围在50pM‑20nM之间，检测限低至41pM。此外，在重复性试验(1.05％至4.22％)和回收率试验(99.5％至104.8％)中均获得了满意的结果。结果表明，该方法在疾病诊断方面具有潜在的应用价值。

A microRNA biosensor based on 3D DNA walking machine coupled with catalytic hairpin self-assembly

【技术实现步骤摘要】
一种3DDNA行走机器耦合催化发夹自组装的microRNA生物传感器
本专利技术涉及一种生物传感器，特别涉及一种简便的、熵驱动的3-DDNA行走机器耦合催化发夹自组装反应用于microRNA检测的生物传感器
技术介绍
DNA机器是由DNA构建的分子机器，由于WatsonCrick碱基配对规则的通用性和可预测性，可以对其进行逻辑设计。各种DNA机器都是通过高度可编程的方法构建和合成的，它包括DNA镊子、DNA马达、DNA步行者和DNA机器人。其中，DNA步行者可以在微米尺度或纳米尺度的程序化寡核苷酸轨道中进行精确控制，在生物传感器、生物计算、药物递送中具有重要的应用潜力。之前的研究已经报道了DNA步行机沿着一维(1D)轨道、二维(2D)折纸、或三维(3D)轨道上进行移动。其中3DDNA步行者拥有更加强大的信号放大能力，这归因于其所有的反应局限在微米级或者是纳米级的材料上，提高了反应物的局部浓度产生了更稳定的信号输出。因此，3DDNA步行者的应用已经引起了人们的广泛关注。例如，Li和同事设计了一种酶驱动的DNAwalker传感器，它具有三维轨迹，能够实现对特定核酸的检测；Fan等人设计了一种由核酸外切酶III驱动的随机DNA步行者，可用于超灵敏的生物分析和级联信号放大。Liu和他的同事描述了一种用于检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷的三维DNA步行者，它比以前报道的方法低了三个数量级。虽然这些方法具有较高的灵敏度，但它们都依赖于酶，易受复杂条件(如缓冲液和温度)的影响，检测成本高，不易长期储存。因此，研究非酶的三维DNA步行者引起了了人们的强烈关注。最近，Ye和他的同事报道了一个由熵驱动反应(EDR)促发的在金纳米粒子(AuNPs)上行走的三维DNA漫步者。与依赖酶的信号放大系统相比，熵驱动反应是一种不需要酶或精确温度循环的催化放大信号策略。在熵增加的情况下，利用一串单核酸链通过toehold介导的链置换反应在催化电路中发挥多重作用。由于其独特和非凡的驱动力，系统的总碱基对数在放大过程中保持不变，从而减少了电路泄漏的机会，为准确检测提供了更可靠的平台。在EDR的帮助下，上述三维DNA步行者在miRNA的成像方面具有较高的敏感性。然而，AuNPs作为三维轨道基质有着不可避免的局限性。一方面，DNA与AuNPs之间的作用通常是通过金硫键进行连接的。这种连接作用力不够强，难以避免非特异的DNA吸附，严重阻碍了DNA杂交，降低了胶体稳定性。另一方面，它需要将亲和配体和三核酸复合物固定在AuNPs表面，并对他们的比例进行相应的优化，导致DNA和AuNPs共轭产物的重复性较差。的比例进行相应的优化，导致DNA和AuNPs共轭产物的重复性较差。解决上述问题的一个可行方法是寻找用来固定DNA的其他底物。单分散的聚苯乙烯微球由于表面积大、表面反应能力强，在DNA条码检测中得到了广泛的应用。更重要的是，商品化的链霉亲和素修饰的聚苯乙烯微球可以通过亲和素-生物素反应很容易地功能化，具有良好的重复性。链霉亲和素与生物素的结合作用力比Au-S键强得多。因此，链霉亲和素包覆聚苯乙烯微球可作为构建三维DNA步行者的潜在底物。与此同时，在DNA机器的构建中利用等温扩增技术实现生物分子的敏感检测已引起了人们越来越多的兴趣。催化发夹自组装(CHA)是一种经济有效的无酶级联扩增策略。因此基于熵驱动的三维DNA步行者和CHA的优点引起了我们对核酸检测领域的兴趣。在目前的工作中，我们提出一种新的基于熵驱动的三维DNA步行者与CHA催化发夹自组装反应相耦合的生物传感器，实现了对皮摩尔水平miRNA的敏感检测。我们使用miRNA21作为模型目标，它与包括血液癌症在内的许多疾病密切相关。在该系统中，miRNA21作为催化剂和随机DNA步行者，在聚苯乙烯微球的表面不断移动，导致固定在微球上的三核酸复合物分解，并释放大量辅助核酸(AS)，实现了miRNA21的循环。同时，AS可以催化CHA反应产生高信号输出。由于熵驱动反应的引入，它在区别于其他同源miRNAs时具有显著的选择性，除了miRNA-200b外其它几种miRNA的信号占miR-121的信号不到5％。该复合生物传感器工作可在50pM到20nM浓度范围内工作，检测限低至41pM。此外，在重复性试验(从1.05％到4.22％)和回收率试验(从99.5％到104.8％)中均取得了满意的结果。
技术实现思路
本专利技术的目的是开发出一种简单、特异、灵敏检测RNA的生物传感器。具体技术方案如下：一种简便的、熵驱动的3-DDNA行走机器耦合催化发夹自组装反应用于microRNA检测的生物传感器，其制备方法包括以下步骤：(1)3-DDNA行走机器的制备将纯化后的三条核酸链LS、AS、S和TEMg缓冲液经退火后重新折叠以制备LS/AS/S三核酸复合物(C3)。LS∶AS∶S的比值为1∶1.5∶1.5。退火过程是将溶液在PCR仪里加热到95℃，5min，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度慢慢降低到25℃。接着将链霉亲和素修饰的聚苯乙烯微球(PS)50μL以12000转离心5分钟，用bindingbuffer洗涤2次后离心弃去上清液。再用50μLbindingbuffer重悬浮后加入5μLμMC3。在37℃恒温箱孵育15分钟后，用TEMg缓冲液洗涤3次，12000转离心5分钟弃去上清。最后再用50μL的TEMg缓冲液重悬浮，最后DNA功能化的3-DDNA行走机器(C3/PS)制备完成。(2)信号探针的制备将发夹探针(H1)和发夹探针(H2)退火后重新折叠。将溶液在PCR仪里加热到95℃，5min，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度慢慢降低到25℃。将标记了FAM的信号探针RepF，标记了BHQ1的信号探针RepQ以1∶2的比例在1×TNaK缓冲液中杂交。(3)MicroRNA的检测将5μLC3/PS复合物，2μL，10μM燃料核酸(FS)，33μLcutsmart缓冲液，和10μL不同浓度的目标物在37℃恒温箱孵育60分钟。然后离心分离取40μL的上层清液添加到含有5μL1μMH1，2μL10μMH2，10μL50nMRepF：RepQ复合物和23μL1×TNaK缓冲液中，在室温下避光反应60分钟。最后用荧光分光光度计测量荧光信号。所述步骤(1)中LS∶AS∶S的比值为1∶1.5∶1.5。所述步骤(2)中RepF和RepQ的比例是1∶2。所述步骤(3)中熵驱动是在37℃恒温箱孵育60分钟所述步骤(3)中催化发夹自组装反应在室温下避光反应60分钟本专利技术建立了一种以聚苯乙烯微球为轨道的3DDNA行走机器并耦合催化发夹自组装反应用来灵敏的检测miRNA的生物传感器。其检测原理为，连接核酸(LS)、辅助核酸(AS)、基质核酸(S)可以通过碱基互补配对原则形成三核酸复合物(C3)，在连接核酸(LS)的5’端修饰生物素，三核酸复合物可以通过链霉亲和素反应固定在修饰了链霉亲和素的聚苯乙烯微球上。在目标miRNA21(T)存在的条件本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种简便的、熵驱动的3-D DNA行走机器耦合催化发夹自组装反应用于microRNA检测的生物传感器，其制备方法包括以下步骤：/n(1)、3-D DNA行走机器的制备/n将纯化后的三条核酸链LS、AS、S和TEMg缓冲液经退火后重新折叠以制备LS/AS/S三核酸复合物(C3)。LS∶AS∶S的比值为1∶1.5∶1.5。退火过程是将溶液在PCR仪里加热到95℃，5min，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度慢慢降低到25℃。接着将链霉亲和素修饰的聚苯乙烯微球(PS)50μL以12000转离心5分钟，用binding buffer洗涤2次后离心弃去上清液。再用50μL binding buffer重悬浮后加入5μLμM C3。在37℃恒温箱孵育15分钟后，用TEMg缓冲液洗涤3次，12000转离心5分钟弃去上清。最后再用50μL的TEMg缓冲液重悬浮，最后DNA功能化的3-D DNA行走机器(C3/PS)制备完成。/n(2)、信号探针的制备/n将发夹探针(H1)和发夹探针(H2)退火后重新折叠。将溶液在PCR仪里加热到95℃，5min，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度慢慢降低到25℃。将标记了FAM的信号探针RepF，标记了BHQ1的信号探针RepQ以1∶2的比例在1×TNaK缓冲液中杂交。/n(3)、MicroRNA的检测/n将5μL C3/PS复合物，2μL 10μM燃料核酸(FS)，33μL cutsmart缓冲液，和10μL不同浓度的目标物在37℃恒温箱孵育60分钟。然后离心分离取40μL的上层清液添加到含有5μL 1μMH1，2μL 10μM H2，10μL 50nM RepF：RepQ复合物和23μL 1×TNaK缓冲液中，在室温下避光反应60分钟。最后用荧光分光光度计测量荧光信号。/n...

【技术特征摘要】
1.一种简便的、熵驱动的3-DDNA行走机器耦合催化发夹自组装反应用于microRNA检测的生物传感器，其制备方法包括以下步骤：
(1)、3-DDNA行走机器的制备
将纯化后的三条核酸链LS、AS、S和TEMg缓冲液经退火后重新折叠以制备LS/AS/S三核酸复合物(C3)。LS∶AS∶S的比值为1∶1.5∶1.5。退火过程是将溶液在PCR仪里加热到95℃，5min，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度慢慢降低到25℃。接着将链霉亲和素修饰的聚苯乙烯微球(PS)50μL以12000转离心5分钟，用bindingbuffer洗涤2次后离心弃去上清液。再用50μLbindingbuffer重悬浮后加入5μLμMC3。在37℃恒温箱孵育15分钟后，用TEMg缓冲液洗涤3次，12000转离心5分钟弃去上清。最后再用50μL的TEMg缓冲液重悬浮，最后DNA功能化的3-DDNA行走机器(C3/PS)制备完成。
(2)、信号探针的制备
将发夹探针(H1)和发夹探针(H2)退火后重新折叠。将溶液在PCR仪里加热到95℃，5min，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度慢慢降低到25℃。将标记了FAM的信号探针RepF，标记了BHQ1的信号探针RepQ以1∶2的比例在1×...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢国明，杨廷燕，方杰，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50