检测食品中海狸鼠源性成分的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供检测食品中海狸鼠源性成分的试剂盒及其应用。所述试剂盒中含有检测食品中海狸鼠源性成分的特异性PCR引物对及荧光探针，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1‑3所示。本发明专利技术还提供基于所述引物对和荧光探针建立的食品中海狸鼠源性成分的实时荧光定量PCR检测方法。本发明专利技术试剂盒特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好(可检测到样品中100 fg的海狸鼠源性成分)，为食品中海狸鼠源性成分的检测提供了新方法。本发明专利技术提供的荧光定量PCR技术可以准确快速地实现对食品中海狸鼠源性成分的鉴别检测，可在1～2h内完成检测，具有快速、特异、敏感、高通量等优点。

A kit for the detection of nutria derived components in food and its application

【技术实现步骤摘要】
检测食品中海狸鼠源性成分的试剂盒及其应用
本专利技术涉及荧光定量PCR检测技术，具体地说，涉及检测食品中海狸鼠源性成分的试剂盒及其应用。
技术介绍
随着我国经济发展水平的提高，居民餐桌上动物源食品的比重越来越高。市场上的肉制品因其来源不同价格差异很大，造成了一些不法商贩以便宜的肉类冒充或掺混进贵的肉类中贩卖，这些以假乱真，以次充好的行为严重侵害了消费者的利益。近年来，各种以皮毛动物的肉冒充牛羊肉在市场上贩卖的报道屡见报端，除了狐狸、水貂外，海狸鼠肉也是不法商贩进行肉类掺混的重要来源。海狸鼠是一种大型啮齿动物，其皮毛可做衣料，在国外已有百余年的人工饲养历史，鉴于海狸鼠的经济价值较高，我国于1956年首次引处饲养，如今在全国各省被广泛养殖。为便于市场监管，建立一种快速准确的海狸鼠源性成分检测方法十分必要。食品中动物源性成分的检测主要分为两类，一是以蛋白质为基础的方法如色谱法、质谱法；二是以核酸为靶位点的检测方法，如普通PCR法、荧光PCR法、基因芯片法等。由于核酸热稳定性较强，不易随加工过程变性分解，基于核酸的检测技术更适合应用于食品中。随着分子生物学技术的法展，以聚合酶链式反应(PCR)为基础的技术已成为食品中动物源性成分鉴定的核心方法。相对于普通PCR技术，荧光PCR技术特异性强，灵敏度高，检测用时短，能有效提高检测效率，更有利于加强市场监管的时效性。哺乳动物线粒体DNA(mtDNA)在遗传上相对独立，基因组小，拷贝数多，既有保守区又有可变区。因此，与核DNA分子标记相比，用mtDNA分子标记鉴别动物源性成分具有灵敏度高、精确度好、DNA降解小等优势。基于动物线粒体DNA的荧光PCR检测技术在动物源性成分鉴别中具有广阔的应用前景。目前，根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物，建立PCR与实时荧光PCR方法已见大量报道，然而，针对海狸鼠源性成分检测的荧光PCR方法尚未见报导。因此，建立动物源性产品中海狸鼠源性成分实时荧光定量PCR检测方法，对提高突发事件应急处理能力，提升食品安全风险监测水平和监管能力具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供检测食品中海狸鼠源性成分的试剂盒及其应用。本专利技术的另一目的是提供检测食品中海狸鼠源性成分的特异性PCR引物对、与其配合使用的荧光探针以及基于所述引物对和荧光探针建立的食品中海狸鼠源性成分的实时荧光定量PCR检测方法。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供检测食品中海狸鼠源性成分的特异性PCR引物对，包括上游引物和下游引物，它们的核苷酸序列如SEQIDNO:1-2所示。第二方面，本专利技术提供与所述引物对配合使用的荧光探针，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。第三方面，本专利技术提供所述引物对和/或所述荧光探针的以下任一应用：A、在检测食品中海狸鼠源性成分中的应用；B、在制备食品中海狸鼠源性成分的检测试剂或试剂盒中的应用。本专利技术的试剂盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或者多个可以装有本专利技术的引物以及荧光探针，根据需要该引物和荧光探针可以是冻干形式或溶于缓冲液中。另外，本专利技术的试剂盒中还可以包括用于荧光定量PCR反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本专利技术所需要的其它成分及用具，例如所述试剂盒优选还包括DNA裂解液、荧光定量反应液、阳性标准模板、阴性模板(ddH2O)等中的至少一种。第四方面，本专利技术提供检测食品中海狸鼠源性成分的方法(实时荧光定量PCR检测法)包括以下步骤：1)提取待测样品中的DNA；2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用所述引物对和所述荧光探针进行PCR扩增反应；3)分析PCR扩增产物。20μLPCR反应体系为：PCR反应程序为：95℃预变性5-10min；95℃变性15s，60℃退火及延伸1min，40个循环。本专利技术每次检测样本时需设立阴性对照和阳性对照。样本结果判断标准如下：①具有S型扩增曲线，Ct值<35.0时样品结果为阳性；②Ct值≥40.0时样品结果为阴性；③若检测结果Ct值在35-40之间应调整DNA浓度进行复检。优选地，步骤1)采用蛋白酶K消化法提取的食品样品中的DNA。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术试剂盒特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好(可检测到样品中100fg的海狸鼠源性成分)，为食品中海狸鼠源性成分的检测提供了新方法。本专利技术提供的荧光定量PCR技术可以准确快速地实现对食品中海狸鼠源性成分的鉴别检测，可在1～2h内完成检测，具有快速、特异、敏感、高通量等优点，不仅能为检测海狸鼠源性食品提供新的方法，而且能有效抵御肉制品掺假，加大对消费者利益的保护力度。附图说明图1为本专利技术海狸鼠CYTB-Probe探针的设计位置。图2为本专利技术实施例3中利用实时荧光定量PCR检测法对25种动物DNA的检测结果；其中，1-为海狸鼠，2-其余24种动物及阴性对照。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1引物的设计及优化经大量比对GenBank中公布的CYTB基因序列，选取CYTB基因具有物种特异性基因序列为模板，设计海狸鼠CYTB特异性引物对和Taqman探针，分别命名为海狸鼠CYTB-F、海狸鼠CYTB-R、海狸鼠CYTB-Probe，用于Taqman实时荧光PCR扩增的引物和探针序列如下：海狸鼠CYTB-F：5`-ACTACTCCCCATACTCCATATTTCAAA-3`(SEQIDNO:1)海狸鼠CYTB-R：5`-TTACTAGGATTCATAGGAGGGATTGG-3`(SEQIDNO:2)海狸鼠CYTB-Probe：5`-FAM-CAACGTGCCATAACATTCCGCCCA-BHQ1-3`(SEQIDNO:3)线粒体基因组具有分子结构简单、无重组、与核基因组无共同序列、进化速率快、多拷贝及分子钟理论等优点，相比核DNA更容易检测，亲缘关系相近的物种都能够得到区分和鉴定。细胞色素b(Cytochromeb,Cytb)基因作为一种线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA),就其结构和功能而言是mtDNA的13个蛋白质编码基因中了解得最清楚的基因之一。Cytb基因与其他线粒体基因相比进化速度适中，它在属间、种间具有多样性，常用作种间及科以上分类单位的进化研究。本专利技术通过将海狸鼠Cytb基因与其亲缘关系相近的物种Cytb基因进行比对，选择特异性较强的906～988位碱基作为靶区域进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测食品中海狸鼠源性成分的特异性PCR引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，它们的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示。/n

【技术特征摘要】
1.检测食品中海狸鼠源性成分的特异性PCR引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，它们的核苷酸序列如SEQIDNO:1-2所示。


2.与权利要求1所述引物对配合使用的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。


3.权利要求1所述引物对和/或权利要求2所述荧光探针的以下任一应用：
A、在检测食品中海狸鼠源性成分中的应用；
B、在制备食品中海狸鼠源性成分的检测试剂或试剂盒中的应用。


4.食品中海狸鼠源性成分的检测试剂或试剂盒，其特征在于，有效成分为权利要求1所述引物对和/或权利要求2荧光探针。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA裂解液、荧光定量反应液、阳性标准模板中的至少一种。


6.检测食品中海狸鼠源性...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛晨玉，王丹，杨红莲，罗晓轩，尹华涛，宋丽萍，毛婷，李赫婧，郭淼，毕思丹，
申请(专利权)人：北京市食品安全监控和风险评估中心北京市食品检验所，
类型：发明
国别省市：北京;11