检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法技术

本发明专利技术公开了检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法，属于基因工程以及遗传育种技术领域。与传统的基于4P‑ARMS‑PCR、PCR‑RFLP、PCR‑SSCP以及Sanger测序检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法相比，本发明专利技术的方法基于特异性引物对以及高分辨率熔解曲线分析，这使得本发明专利技术的方法仅需通过一次PCR，无需酶切或者测序等手段，即可将绵羊MSTN基因g.+6723位点的三种基因型AA、AG和GG进行分型，检测效率极高且操作简便。

The method of detecting the g. + 6723 genotype of MSTN gene in sheep

【技术实现步骤摘要】
检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法
本专利技术涉及检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法，属于基因工程以及遗传育种

技术介绍
绵羊肌肉的产量和质量决定了绵羊品种的肉用性能。肉用绵羊产肉性能的好坏，除与营养和饲养管理等因素有关外，还与遗传因素密切相关，即受绵羊体内与肌肉生长发育相关的基因的调控。肌肉生长抑制素基因(Myostatin，MSTN)，也称生长分化因子8(differentiationfactor8，GDF8)，属于转化生长因子超家族成员，是肌肉生长的负调控因子(具体可见参考文献：McPherron,A.C.andS.Lee,DoubleMusclinginCattleDuetoMutationsintheMyostatinGene.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1997.94(23):p.12457-12461.)。该基因的突变失活，能阻断MSTN对肌细胞增殖生长的抑制作用，引起广泛的肌肉增殖并显著降低脂肪的沉积(具体可见参考文献：Grobet,L.,etal.,Moleculardefinitionofanallelicseriesofmutationsdisruptingthemyostatinfunctionandcausingdouble-musclingincattle.MammalianGenome,1998.9(3):p.210-213.)。<br>2006年，Clop等报道了在德克赛尔羊MSTN基因3’UTR区的g.+6723G>A突变，该突变的出现使得该处的寡核苷酸序列成为肌肉细胞中高表达的两个microRNA，即mir1和mir206的结合位点，从而影响了MSTN基因mRNA的翻译，出现类似“双肌”的表型(具体可见参考文献：Clop,A.,etal.,AmutationcreatingapotentialillegitimatemicroRNAtargetsiteinthemyostatingeneaffectsmuscularityinsheep.NatureGenetics,2006.38(7):p.813-818.)。有研究表明，MSTN基因g.+6723位点G>A纯合突变的绵羊(AA)与野生型(GG)相比，胴体重和肌肉重均显著增加，且脂肪沉积减少(具体可见参考文献：Haynes,F.E.M.,etal.,Lackofassociationbetweenallelicstatusandmyostatincontentinlambswiththemyostating+6723G>Aallele1.JournalofAnimalScience,2013.91(1):p.78-89.)。另有研究表明，携带该突变的杂交绵羊(AG)比不携带该突变的绵羊(GG)具有更高的屠宰率和肌肉质量(具体可见参考文献：Hope,M.,etal.,Theeffectsofthemyostating+6723G>Amutationoncarcassandmeatqualityoflamb.MeatScience,2013.95(1):p.118-122.)。因此，筛选携带MSTN基因g.+6723位点G>A突变的绵羊对培育高产肉用绵羊新品系(种)十分重要。目前，针对某一特定SNP位点的检测方法主要包括基于PCR的四引物扩增受阻突变系统聚合酶链式反应(4P-ARMS-PCR)(具体可见参考文献：Polley,S.,etal.,PolymorphismofBMPR1B,BMP15andGDF9fecunditygenesinprolificGarolesheep.TropicalAnimalHealthandProduction,2010.42(5):p.985-993.)、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(PCR-RFLP)(具体可见参考文献：Hanrahan,J.P.,etal.,MutationsintheGenesforOocyte-DerivedGrowthFactorsGDF9andBMP15AreAssociatedwithBothIncreasedOvulationRateandSterilityinCambridgeandBelclareSheep(Ovisaries)1.BiologyofReproduction,2004.70(4):p.900-909.)、单链构象多态性聚合酶链式反应(PCR-SSCP)以及直接测序等(具体可见参考文献：Dehnavi,E.,etal.,PolymorphismofMyostatinGeneinIntron1and2andExon3,andTheirAssociationswithYearlingWeight,UsingPCR-RFLPandPCR-SSCPTechniquesinZelSheep.BiotechnologyResearchInternational,2012.2012:p.1-5.)。然而，这些方法或步骤繁琐、难度大，或成本高、周期长，或通量低、检测效率低(具体可见参考文献：Escobar-Chaparro,R.A.,etal.,qPCRandHRM-baseddiagnosisofSNPsongrowthdifferentiationfactor9(GDF9),ageneassociatedwithsheep(Ovisaries)prolificacy.3Biotech,2017.7(3).)，不利于在育种实践中的大规模应用和推广。因此，急需建立一种针对MSTN基因g.+6723位点的效率高、成本低且操作简便的满足育种实践需求的基因型检测方法。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提供一种效率高、成本低且操作简便的检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法。[技术方案]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一组可用于检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的引物对，所述引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:11所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:12所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述绵羊为戴瑞羊、东弗里生羊、德克赛尔羊、萨福克羊、杜泊羊、多赛特羊、蒙古羊、小尾寒羊、滩羊或湖羊。本专利技术还提供了一种检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法，所述方法为以已知MSTN基因g.+6723位点基因型的绵羊的基因组DNA作为内标，先使用上述引物对对MSTN基因g.+6723位点的基因型为AA的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为AG的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为GG的绵羊的基因组DNA以及待测绵羊的基因组DNA进行扩增，然后对扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，最后根据待测绵羊的基因组DNA扩增获得的高分辨率熔解曲线与MSTN基因g.+6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组可用于检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的引物对，其特征在于，所述引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。/n

【技术特征摘要】
1.一组可用于检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的引物对，其特征在于，所述引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:11所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:12所示。


2.一种检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法，其特征在于，所述方法为以已知MSTN基因g.+6723位点基因型的绵羊的基因组DNA作为内标，先使用权利要求1所述的引物对对MSTN基因g.+6723位点的基因型为AA的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为AG的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为GG的绵羊的基因组DNA以及待测绵羊的基因组DNA进行扩增，然后对扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，最后根据待测绵羊的基因组DNA扩增获得的高分辨率熔解曲线与MSTN基因g.+6723位点的基因型为AA的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为AG的绵羊的基因组DNA以及MSTN基因g.+6723位点的基因型为GG的绵羊的基因组DNA扩增获得的高分辨率熔解曲线判断待测绵羊MSTN基因g.+6723位点的基因型。


3.如权利要求2所述的一种检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法，其特征在于，所述扩增以及高分辨率熔解曲线分析均在实时荧光定量PCR仪上进行。


4.如权利要求3所述的一种检测绵羊MSTN基因g.+6723位点基因型的方法，其特征在于，所述高分辨率熔解曲线由实时荧光定量PCR仪配套软件的GeneScanning模块自动生成；所述判断的程序为：先在实时荧光定量PCR仪配套软件的genescanning模块中将MSTN基因g.+6723位点的基因型为AA的绵羊的基因组DNA、MSTN基因g.+6723位点的基因型为...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑重，张立，李光鹏，张晓然，张功，
申请(专利权)人：内蒙古大学，蒙天然牧业科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙;15