本发明专利技术涉及分子标记技术领域，特别涉及一种中国鲎SSR引物组及其应用，本发明专利技术通过对中国鲎进行DNA提取，经过测序和组装，设计相应的SSR引物，以北部湾地区多个中国鲎基因组DNA为材料，对设计的SSR引物进行验证，获得164对SSR引物能在中国鲎中扩增，选取其中20对多态SSR引物对中国鲎进行分子遗传标记，可区分北部湾地区多个中国鲎样本基因，对北部湾地区不同品种的中国鲎进行聚类分析，为今后开展遗传育种、基因定位、物种亲缘关系鉴别和中国鲎遗传资源保护等研究提供新的思路。
【技术实现步骤摘要】
一种中国鲎SSR引物组及其应用
本专利技术涉及分子标记
，特别涉及一种中国鲎SSR引物组及其应用。
技术介绍
中国鲎具有很高的经济及医药价值，以其血液为原料制作的鲎试剂可用于检测细菌内毒素，其肉、壳、尾皆可入药，在我国广西、海南、广东、香港、福建、台湾、浙江等沿海省份和地区均有分布。近年来，由于过度捕捞和环境恶化等人为或非人为因素导致中国鲎数量明显下降，频临灭绝。对于一个物种而言，其遗传多样性越高表明其对生存环境变化的潜在适应能力越强，中国鲎物种保护的实质在于保护其遗传的多样性，开展中国鲎遗传多样性研究对于保护我国这一物种资源具有十分重要的意义。现存的中国鲎主要分布于北部湾海域，对该海域中国鲎多样性的调查和物种资源的保护最为迫切。本研究利用SSR分子标记揭示北部湾中国鲎遗传多样性，掌握北部湾海域中国鲎的遗传多样性及其遗传结构，为中国鲎的保护提供策略和可靠的科学依据。中国鲎物种保护的内在实质就是对其遗传多样性的保护，目前，国内对中国鲎的研究多见于资源分布及保育和鲎试剂及重组鲎素抗菌肽方面。研究中国鲎的技术方法相对较少，从微卫星标记(MicrosatelliteDNA)分离方面对中国鲎进行研究的报道较为少见，由于中国鲎品种保护的缺陷，使得适合中国鲎生长的环境资源日益衰退，因此，目前用于中国鲎类研究的样本很少，难以很准确的反映中国鲎遗传多样性的真实情况；同时也表明目前对中国鲎的遗传多样性处于起步阶段，这些结果尚不能为中国鲎的保护提供有力的科学依据，为了能全面有效的对中国鲎进行研究，有必要开展本申请的研究工作，为中国鲎的SSR标记开展新的研究思路。
技术实现思路
鉴于上述内容，有必要提供一种中国鲎SSR引物组及其应用，该引物能为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的思路。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种中国鲎SSR分子标记引物组，所述SSR引物组的序列如SEQIDNO.1～328所示。本申请还提供一种应用所述SSR分子标记引物组进行遗传分析的应用，所述应用可用于中国鲎的聚类分析。本申请还提供一种应用所述SSR分子标记引物组进行遗传分析的应用，所述应用可用于不同中国鲎品种遗传多样性。本申请还提供一种应用所述SSR分子标记引物组进行中国鲎聚类分析的方法，所述方法包括如下步骤：(1)中国鲎基因组的提取：对鲎血和鲎肌肉的基因组DNA进行提取，并稀释成20ng·μL-1,置于-20℃冰箱保存备用；(2)设计样品中国鲎的SSR引物：对步骤(1)的DNA进行测序，测序完成后进行质量控制，构建中国鲎的Unigene序列；对SSR位点检索，获得并设计一系列SSR位点的引物；(3)对步骤(2)的SSR引物进行检测，得出164对SSR引物组；(4)中国鲎群体扩增：用步骤(3)的引物组中20对多态引物对样本鲎群体204个个体进行PCR扩增分析，将读取的条带信息应用GenAlEx6.502软件进行统计分析；估算不同地域品种来源的中国鲎其等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和PIC值，同时，计算出遗传距离；以UPGMA算法对中国鲎进行聚类分析。进一步的，其特征在于，所述步骤(4)的PCR扩增反应体系为10μL，其组分为：1.0μL的模板DNA、各0.4μL的上下游引物(10mmol/L)、1.0μL的dNTPs(2.5mmol/L)、1.0μL的10×Buffer、1.5U的rTaq、最后加入6.2μL的ddH2O补足10μL。进一步的，其特征在于，所述步骤(4)的PCR扩增反应程序为：预变性95℃4min，变性95℃45sec，退火55℃45sec,延伸72℃45sec，33个循环，72℃延伸7min，4℃保存；或：预变性95℃4min，变性95℃45sec，退火60℃45sec,延伸72℃45sec,33个循环，72℃延伸7min，4℃保存。进一步的，其特征在于：所述步骤(4)的不同地域为钦州、北海和防城港。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术以鲎血和鲎肌肉为材料，提取中国鲎的DNA经过检测、分析得到相应的SSR引物，找到适合应用于中国鲎聚类分析的SSR引物组，本引物组具有较高的PIC值，利用SSR引物组进行PCR分析并绘制聚类分析图，为今后开展遗传育种、基因定位、物种亲缘关系鉴别和中国鲎遗传资源保护等研究提供新的引物和思路。【附图说明】图1是本专利技术实施例SSR标记开发中四种核苷酸重复单元出现的频率；图2是本专利技术实施例SSR标记开发中重复单元的组成成分；图3是本专利技术实施例参试鲎聚类分析图。【具体实施方式】为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施的限制。实施例：一、实验方法：1、鲎基因组DNA的提取方法：分别采用天根生化科技(北京)有限公司生产的血液组织基因组DNA提取试剂盒(DP318-02)和海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(DP324-03)对鲎血和鲎肌肉的基因组DNA进行提取，并稀释成20ng·μL-1,置于-20℃冰箱保存备用。2、中国鲎SSR引物组的设计：以步骤1的中国鲎DNA为材料构建300bp和500bp两个基因组文库。首先利用IlluminaHiSeq4000平台对文库进行测序，测序完成后进行序列组装得到的序列总大小为318451264bp，序列总数为216448条，每个序列平均长度为1471bp，利用Trimmomatic对测序结果进行质量检测，去除污染序列、接头和低质量序列得到CleanData；再利用SOAPdenovo对CleanData进行组装得到unigenes；接下来利用Misa脚本在unigenes中搜索SSR位点，识别出含有SSR位点的序列总数为2581条，其中每个序列中包含多个SSR位点的序列为35条，每个序列中仅含1个SSR位点的有2546条，平均每123382bp或每84条序列中就有一个SSR位点，设计相应SSR位点的引物，从已开发出的只含有一个SSR位点的2546条序列中，筛选出了Km为55℃的共62对引物和Km为60℃的共142对引物，总共设计了204对引物。3、SSR多态引物筛选设置二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸五个重复单元。从2581条包含有SSR位点的序列中筛选出的重复单元为二核苷酸的有1608条序列，占比62.30％、三核苷酸的有38条，占比1.47％、四核苷酸的有921条，占比35.68％、五核苷酸14条，占比0.54％图1；具体的重复单元类型和数量见图2。从只含有一个SSR位点的2546条本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种中国鲎SSR分子标记引物组，其特征在于，所述SSR引物组的序列如SEQ ID NO.1～328所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种中国鲎SSR分子标记引物组，其特征在于，所述SSR引物组的序列如SEQIDNO.1～328所示。
2.一种应用权利要求1所述SSR分子标记引物组进行遗传分析的应用，所述应用可用于中国鲎的聚类分析。
3.一种应用权利要求1所述SSR分子标记引物组进行遗传分析的应用，所述应用可用于不同中国鲎品种遗传多样性。
4.一种应用权利要求1所述SSR分子标记引物组进行中国鲎聚类分析的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)中国鲎基因组的提取：对鲎血和鲎肌肉的基因组DNA进行提取，并稀释成20ng·μL-1,置于-20℃冰箱保存备用；
(2)设计样品中国鲎的SSR引物：对步骤(1)的DNA进行测序，测序完成后进行质量控制，构建中国鲎的Unigene序列；对SSR位点检索，获得并设计一系列SSR位点的引物；
(3)对步骤(2)的SSR引物进行检测，得出164对SSR引物组可以在中国鲎基因组中扩增；
(4)中国鲎群体扩增：用步骤(3)的引物组中的20对多态引物对样本鲎群体204个个体进行PCR扩增分析，将读取的条带信息应用GenAlEx6.502软件进行统计分析；估算不同地域品种来源的中...
【专利技术属性】
技术研发人员：王鹏良，廖永岩，许尤厚，吴海萍，朱鹏，吴双成，黄志兴，苏洁霞，李艺，谢雅榆，邓洁梅，
申请(专利权)人：北部湾大学，
类型：发明
国别省市：广西;45
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