一种用于转座酶片段化的试剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于转座酶片段化的试剂，其包括独立包装的如下组件：Tn5转座酶、第一接头、第二接头以及转座反应缓冲液。进一步的，所述试剂还包括独立包装的正向引物的集合、反向引物的集合、DNA聚合酶、DNA聚合酶反应缓冲液，以及片段化反应缓冲液、终止溶液等组件。本发明专利技术还提供了包括所述试剂的试剂盒。本发明专利技术提供的试剂及试剂盒便于使用，成本低廉，既可避免现有商品化转座体系稳定性差、用途单一、成本高昂等缺陷，而且使用灵活性好，适应多种实际需求。特别是，利用所述试剂及试剂盒进行片段化核酸文库的构建时，仅需10min即可完成DNA片段化、末端修复和接头连接过程，可以显著缩短建库时间，并获得优异的测序质量。

【技术实现步骤摘要】
一种用于转座酶片段化的试剂及其应用
本专利技术涉及一种试剂盒，特别涉及一种用于转座酶片段化的试剂及试剂盒，属于分子生物学设备

技术介绍
传统建库流程繁琐，一般要经过以下几个步骤：(1)将待测序的DNA分子用超声波打碎；(2)将打碎后的基因组进行末端补平；(3)在补平后的片段3’端加A和5’端进行磷酸化；(4)对修复后的片段进行接头连接；(5)对接头连接后DNA片段进行PCR扩增；(6)对扩增后的文库进行磁珠纯化。转座法建库相对于传统建库，其实验方法简单快速，将DNA片段化、末端修复和接头连接过程集中于一个体系完成，最快5分钟内即可同时完成DNA片段化和接头连接，而且所需要的DNA量少。然而目前市面上能提供的Tn5转座法建库试剂盒普遍存在只适用于文库构建，适用范围单一，且采购成本相对较高，预定周期较长等缺陷。例如，Illumina公司提供的商品化转座体系包括由转座酶和两种等摩尔的接头(Adapter)1、2构成一个完整转座子的mix体系，价格昂贵，且专为Illumina高通量测序平台而开发，用途单一。此外，现有的商品化试剂盒直接提供转座复合物(Transposome)，转座体稳定性较差，运输过程中剧烈震动颠簸可能都会导致接头脱落，导致片段化效果下降影响最终文库质量和产量。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种用于转座酶片段化的试剂及其应用，以解决现有技术中存在的问题。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案包括：本专利技术实施例提供了一种用于转座酶片段化的试剂，其包括独立包装的如下组件：Tn5转座酶、第一接头、第二接头以及转座体缓冲液，所述Tn5转座酶的序列如SEQIDNO.1所示，所述第一接头的序列如SEQIDNO.2～3所示，所述第二接头的序列如SEQIDNO.4～5所示。进一步的，所述试剂还包括独立包装的正向引物的集合、反向引物的集合、扩增酶、扩增反应缓冲液。进一步的，所述试剂还包括独立包装的片段化反应缓冲液、终止溶液中的任意一种或多种。本专利技术实施例提供了一种试剂盒，其包括前述的任一种试剂。本专利技术实施例提供了一种片段化核酸文库的构建方法，其包括：将Tn5转座酶、第一接头、第二接头于转座反应缓冲液中混合，并在室温下孵育30～120min，获得转座子复合物，之后进行纯化处理，其中所述Tn5转座酶的序列如SEQIDNO.1所示，所述第一接头的序列如SEQIDNO.2～3所示，所述第二接头的序列如SEQIDNO.4～5所示；将纯化后的转座子复合物、人类基因组DNA与片段化反应缓冲液、超纯水混合，并在50～60℃孵育3～15min，取出冰水浴降温1～2min，之后加入终止溶液50～60℃孵育3～7min终止反应，获得片段化产物；之后将片段化产物与正向引物的集合、反向引物的集合、扩增酶、扩增反应缓冲液混合，并进行PCR反应，获得富集的DNA片段。进一步的，所述构建方法还包括：从富集的DNA片段中分选出指定长度的DNA片段，获得片段化核酸文库。与现有技术相比，本专利技术至少具有如下有益效果：提供的用于转座酶片段化的试剂及试剂盒便于使用，成本低廉，既可避免现有商品化转座体系稳定性差、用途单一、成本高昂等缺陷，而且使用的灵活性好，适应多种实际需求，例如适用于1ng～50ng的基因DNA聚合酶组DNA、cDNA、扩增子(>500bp)等样本片段化及index标记。特别是，利用所述试剂及试剂盒进行片段化核酸文库的构建时，与现有方法相比，仅需10min即可完成DNA片段化、末端修复和接头连接过程，显著缩短建库时间，并获得优异的测序质量。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明；图1是本专利技术一具体实施例内DNA片段化步骤中的电泳图，其中1为阴性对照的基因组DNA，2～5为片段化后的DNA；图2是本专利技术一具体实施例内DNA片段富集步骤中的电泳图，其中1为阴性对照的基因组DNA，2～5为片段化后的DNA。具体实施方式现在结合附图和实施例对本专利技术作进一步详细的说明，本专利技术的实施例仅用于说明本专利技术的技术方案，并非限定本专利技术。本专利技术实施例一方面提供的一种用于转座酶片段化的试剂包括独立包装的如下组件：TransposaseTn5(转座酶Tn5)、Adapter1(接头1，即第一接头)、Adapter2(接头2，即第二接头)、Transposomereactionbuffer(转座反应缓冲液)，其中所述Tn5转座酶的序列如SEQIDNO.1所示，所述第一接头的序列如SEQIDNO.2～3所示，所述第二接头的序列如SEQIDNO.4～5所示。其中，通过将转座酶Tn5、接头1、接头2独立包装，而不是直接提供转座复合物，可以避免出现转座复合物在运输过程中出现的接头脱落等缺陷。其中，接头1、接头2的序列可以依据不同需求(例如，甲基化测序、转基因、突变体模式生物构建等)而设计，并且用户可以在使用该试剂盒的过程中，可以自行进行转座复合物的连接(例如，可以单次大量合成转座复合物后-20℃保存，有效期约为1年)。具体地，接头1序列为(Phos表示磷酸化)：5’-Phos-CTGTCTCTTATACACATCT3’-GACAGAGAATATGTGTAGA+接头1具体地，接头2序列为(Phos表示磷酸化)：5’-Phos-CTGTCTCTTATACACATCT3’-GACAGAGAATATGTGTAGA+接头2进一步的，所述第一接头包括第一单链DNA和第二单链DNA，所述第一单链DNA包括依次连接的捕获标签、指定的单链DNA和所述转座酶的识别序列，所述第二单链DNA为所述识别序列的互补序列；所述第二接头包括所述识别序列以及所述识别序列的互补序列。在一些实施方式中，所述试剂还包括独立包装的Primer-indexcomplexF(正向引物集)、Primer-indexcomplexR(反向引物集)、Amplifyenzyme(扩增酶)和Amplifybuffer(扩增缓冲液)。在一些实施方式中，所述试剂还包括独立包装的Tagmentbuffer(片段化反应缓冲液)、Terminatesolution(终止溶液)中的一种或多种，且不限于此。本专利技术实施例另一方面提供的一种试剂盒前述的任一种试剂。在一些实施方式中，所述试剂盒还包括独立包装的DNAtrapbeads(DNA磁珠)，当然也可以替代为其它的固相捕捉试剂。其中的DNA磁珠是本领域悉知的，并可以依据实际应用的需求自制或从市场途径获取。在一些实施方式中，所述试剂盒还包括PCRtube(PCR管)、EPtube(EP管)等，且不限于此。在一些实施方式中，所述试剂盒还包括Ethylalcoholabsolute(无水乙醇)、UPW(超纯水)等溶剂。在本专利技术前述实施例的试剂、试剂盒的应用过程中，可以将转座酶Tn5和等摩尔的接头1、接头2置于转座复合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于转座酶片段化的试剂，其特征在于包括独立包装的如下组件：Tn5转座酶、第一接头、第二接头以及转座反应缓冲液，所述Tn5转座酶的序列如SEQ ID NO.1所示，所述第一接头的序列如SEQ ID NO.2～3所示，所述第二接头的序列如SEQ ID NO.4～5所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于转座酶片段化的试剂，其特征在于包括独立包装的如下组件：Tn5转座酶、第一接头、第二接头以及转座反应缓冲液，所述Tn5转座酶的序列如SEQIDNO.1所示，所述第一接头的序列如SEQIDNO.2～3所示，所述第二接头的序列如SEQIDNO.4～5所示。


2.根据权利要求1所述试剂，其特征在于：所述第一接头包括第一单链DNA和第二单链DNA，所述第一单链DNA包括依次连接的捕获标签、指定的单链DNA和所述转座酶的识别序列，所述第二单链DNA为所述识别序列的互补序列；所述第二接头包括所述识别序列以及所述识别序列的互补序列。


3.根据权利要求1所述试剂，其特征在于还包括独立包装的正向引物的集合、反向引物的集合、扩增酶、扩增反应缓冲液。


4.根据权利要求1所述试剂，其特征在于还包括独立包装的片段化反应缓冲液、终止溶液中的任意一种或多种。


5.一种试剂盒，其特征在于包括权利要求1-3中任一项所述试剂。


6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于还包括独立包装的DNA磁珠。


7.一种片段化核酸文库的构建方法，其特征在于包括：
将Tn5转座...

【专利技术属性】
技术研发人员：张惠丹，戴敬，杨晟，黎晗，
申请(专利权)人：苏州璞瑞卓越生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32