毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用。本发明专利技术中发现毕赤酵母翻译相关因子Bcy1(注释为蛋白激酶A调节亚基)，可以显著提高细胞发酵过程中的生物量，提高增强型绿色荧光蛋白eGFP的表达量，提高植酸酶Phy的表达量，以及可促进毕赤酵母发酵稳定期的细胞生长，增加细胞生物量积累，说明毕赤酵母翻译相关因子Bcy1具有很强的通用性，其在增加发酵过程中生物量积累和提高外源蛋白的产量方面具有良好的应用前景。

Application of Pichia pastoris translation related factor bcy1 in the expression of foreign proteins

The invention discloses the application of Pichia pastoris translation related factor bcy1 in the expression of foreign proteins. In the invention, it is found that bcy1, a translation related factor of Pichia pastoris (Note: protein kinase a regulatory subunit), can significantly improve the biomass in the process of cell fermentation, increase the expression of EGFP, phytase PHY, promote the cell growth in the stable period of Pichia pastoris fermentation, and increase the cell biomass accumulation, indicating that Pichia pastoris translation phase Bcy1 has a strong versatility, and it has a good application prospect in increasing the biomass accumulation and the output of exogenous protein in the fermentation process.

【技术实现步骤摘要】
毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用
本专利技术涉及生物工程领域，特别涉及一种毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用。
技术介绍
毕赤酵母表达系统是通用的、高效的外源蛋白表达系统，广泛地应用于表达和生产各种外源蛋白及研究蛋白的表达和分泌调控机制。除了毕赤酵母物质代谢模块研究外，目前基于蛋白质合成“中心法则”的外源蛋白合成调控模块主要集中在基因转录模块、蛋白质加工折叠模块及其转运分泌模块。然而，基因的转录水平和蛋白表达水平并不是完全一致的，从mRNA到蛋白质需要进行翻译和翻译后修饰等。翻译作为连接mRNA与蛋白质的桥梁，不仅决定多肽的生成速率与合成质量，还影响蛋白质的翻译后易位、折叠、修饰及分泌等。因此，翻译调控对外源蛋白表达至关重要，但是由于翻译调控的严谨性和复杂性，目前在毕赤酵母中发现可提高外源蛋白表达的翻译相关因子少之又少。2009年毕赤酵母基因组信息被公开，毕赤酵母的5000多个基因得到完整的注释。通过序列同源比对和基因功能搜索发现有许多基因编码的蛋白质参与组成翻译系统，即称为翻译相关因子，主要有核糖体蛋白、翻译起始因子、翻译延伸因子、aa-tRNA合成酶、核糖体生物合成因子、核糖体相关的共翻译折叠分子伴侣等几大类。研究发现核糖体生物合成相关的信号因子可营养刺激下调控核糖体生物合成，影响细胞蛋白翻译活力从而改变细胞生长。其中，蛋白激酶A(PKA)信号途径在葡萄糖刺激下，激化核糖体蛋白表达，增加细胞核糖体含量，提高蛋白翻译活性，促进对数期细胞的快速生长。而PKA是cAMP-PKA营养感应信号途径中的关键蛋白，它是一个异源四聚体蛋白，包含两个催化亚基和两个调节亚基，前者由TPK1-3基因编码，后者由BCY1基因编码。环磷酸腺苷(cAMP)与调节亚基Bcy1结合使其与催化亚基解离，从而活化PKA。相反，未结合cAMP的Bcy1可与Tpk1-3紧密结合导致PKA的失活。研究表明PKA可负调控细胞稳定期，抑制二次生长相关基因和压力响应基因的表达。毕赤酵母中Bcy1注释为蛋白激酶A调节亚基，控制多种细胞过程的信号通路的组成部分，包括代谢、细胞周期、应激反应、稳定期和孢子形成等。但到目前为止，尚未有Bcy1促进毕赤酵母发酵稳定期的细胞生长、提高外源蛋白表达的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用。本专利技术的另一目的在于提供所述含有毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的重组载体或重组表达工程菌在外源蛋白表达中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用。所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1来源于毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株，注释为蛋白激酶A(PKA)调节亚基，是控制多种细胞过程的信号通路的组成部分，包括代谢、细胞周期、应激反应、稳定期和孢子形成等，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。所述的外源蛋白为增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和植酸酶(Phy)中的一种，毕赤酵母翻译相关因子Bcy1可以显著提高eGFP和Phy的表达量。所述的增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示，核苷酸序列如SEQIDNo.3。所述的植酸酶(Phy)的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示，核苷酸序列如SEQIDNo.5。编码所述毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，是将所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1表达于毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株；具体通过如下步骤实现：(1)以载体pPICZA为模板，以SEQIDNo.9和SEQIDNo.10为引物进行PCR扩增，得到pPICZA线性片段；然后将pPICZA线性片段与毕赤酵母翻译相关因子Bcy1进行同源重组，得到重组载体pPICZA-Bcy1；(2)将重组载体pPICZA-Bcy1转化至大肠杆菌感受态中，用含Zeocin的培养基进行筛选，再提取质粒转化至毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株中，得到重组表达工程菌。步骤(1)中所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1优选为从毕赤酵母GS115菌株基因组中扩增得到的Bcy1基因片段。步骤(2)中所述的培养基优选为含有Zeocin的LBZ培养基；所述培养基中Zeocin的浓度优选为25μg/ml。步骤(2)中所述的毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株为能够表达外源蛋白增强型绿色荧光蛋白(eGFP)或植酸酶(Phy)的毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株；优选为毕赤酵母GS115/pPIC9K-eGFP、毕赤酵母GS115/pPICZA-HKA-eGFP或毕赤酵母GS115/pPIC9K-Phy工程菌株。所述的毕赤酵母GS115/pPIC9K-eGFP优选为通过如下方法构建得到：(I)将eGFP基因和载体pPIC9K用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接，得到重组载体pPIC9K-eGFP；(II)将重组载体pPIC9K-eGFP电转化至毕赤酵母GS115感受态，得到毕赤酵母GS115/pPIC9K-eGFP。所述的毕赤酵母GS115/pPICZA-HKA-eGFP优选为通过如下方法构建得到：(i)将eGFP基因和载体pPICZA用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接，得到重组载体pPICZA-eGFP；(ii)将载体pPICHKA用限制性内切酶BamHⅠ和MluⅠ进行双酶切，回收HKA(His-Kan-AOX1片段，约5300bp)，然后与用限制性内切酶BamHⅠ和MluⅠ双酶切后的重组载体pPICZA-eGFP连接，得到重组载体pPICZA-HKA-eGFP；(iii)将重组载体pPICZA-HKA-eGFP电转化至毕赤酵母GS115感受态，得到毕赤酵母GS115/pPICZA-HKA-eGFP。所述的毕赤酵母GS115/pPIC9K-Phy优选为通过如下方法构建得到：(a)将Phy基因和载体pPIC9K用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接得到重组载体pPIC9K-Phy；(b)将重组载体pPIC9K-Phy电转化至毕赤酵母GS115感受态，得到毕赤酵母GS115/pPIC9K-Phy。所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，在步骤(2)之后还包括诱导表达的步骤；具体为：将重组表达工程菌接种到培养基中培养至OD600为2.0～6.0，然后转至含有甲醇的诱导培养基中进行诱导表达，得到所述的外源蛋白。所述的培养基优选为BMGY培养基，其组成成分为：1％(v/v)甘油，2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)酵母提取物，1.34％(w/v)酵母氮源(无氨基酸)，100mMpH6.0磷酸钾缓冲液。所述的培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，其特征在于：/n所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1为蛋白激酶A调节亚基，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，其特征在于：
所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1为蛋白激酶A调节亚基，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


2.根据权利要求1所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，其特征在于：
编码所述毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。


3.根据权利要求1所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，其特征在于：
所述的外源蛋白为增强型绿色荧光蛋白和植酸酶中的一种。


4.根据权利要求1～3任一项所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，其特征在于：是将毕赤酵母翻译相关因子Bcy1表达于毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株，具体通过如下步骤实现：
(1)以载体pPICZA为模板，以SEQIDNo.9和SEQIDNo.10为引物进行PCR扩增，得到pPICZA线性片段；然后将pPICZA线性片段与毕赤酵母翻译相关因子Bcy1进行同源重组，得到重组载体pPICZA-Bcy1；
(2)将重组载体pPICZA-Bcy1转化至大肠杆菌感受态中，用含Zeocin的培养基进行筛选，再提取质粒转化至毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株中，得到重组表达工程菌。


5.根据权利要求4所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，其特征在于：
步骤(2)中所述的毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株为能够表达外源蛋白增强型绿色荧光蛋白或植酸酶的毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株。


6.根据权利要求4所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，其特征在于：在步骤(2)之后还包括诱导表达的步骤；具体为：
将重组表达工程菌接种到培养基中培养至OD600为2.0～6.0，然后转至含有甲醇的诱导培养基中进行诱导表达，得...

【专利技术属性】
技术研发人员：林影，廖锡豪，林雯炀，梁书利，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44