一种氟乙酸脱卤酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种氟乙酸脱卤酶突变体，所述氟乙酸脱卤酶突变体的序列包括将SEQ ID NO.1所示的第155位氨基酸残基H、和/或第156位氨基酸残基W进行突变后的序列；所述氟乙酸脱卤酶突变体具有催化溴化底物、尤其是2‑溴丁酸底物的活性。本发明专利技术还提供了一种所述氟乙酸脱卤酶突变体在制备(R)‑2‑溴丁酸和/或(R)‑2‑羟基丁酸中的应用。利用本发明专利技术的氟乙酸脱卤酶突变体制备(R)‑2‑溴丁酸时，生产成本低，立体选择性高，利于工业化生产。

A fluoroacetate dehalogenase mutant and its application

【技术实现步骤摘要】
一种氟乙酸脱卤酶突变体及其应用
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种氟乙酸脱卤酶突变体及其应用。
技术介绍
2-氧代-1-吡咯烷衍生物如左乙拉西坦、布瓦西坦、seletracetam，是比利时UCB公司开发的一种新型抗癫痫药。EP1806339公开了其一种制备方法，其采用(R)-2-溴丁酸与相应的2-氧代-1-吡咯烷化合物进行取代反应，再与三乙胺作用得到相应的产物。其中(R)-2-溴丁酸是其重要原料，对抗癫痫药2-氧代-1-吡咯烷衍生物的生产起着决定作用，因此寻找成本低，光学纯度高的(R)-2-溴丁酸的制备方法非常重要。目前(R)-2-溴丁酸的制备方法有对消旋的2-溴丁酸进行拆分的方法，如JournalofBiologicalChemistry,1927(75),337-365，采用番木鳖碱作为手性拆分剂，这种方法需要多步重结晶步骤，且需要昂贵的手性拆分剂，不利于工业化大生产。或是使用手性辅基拆分消旋的2-溴丁酸，如TetrhedronAsymmetry,16(2005),3739-3745中采用(S)-N-苯基泛内酯作为手性辅基，(S)-N-苯基泛内脂先与2-溴丁酸酯化生成酯化合物，接着再水解为(R)-2-溴丁酸。此方法中酯化产率只有67％，且ee值也不是很理想，并且采用硅胶柱色谱法分离，还不能进行工业化生产。另外还有化学合成的方法，如CN101048402采用(R)-2-氨基丁酸为原料，与亚硝酸，溴化钾反应制得(R)-2-溴丁酸。但是此方法产率很低，且原料为光学纯原料，成本较高。脱卤酶是一种具有催化活性的水解酶，能够催化有机卤素化合物中碳-卤键裂解，使卤素原子从化合物中释放出来。已有相关报道将脱卤酶用于卤代化合物的拆分，如J.Am.Chem.Soc.,2017,ShuguangYuan和ManfredT.Reetz报道了氟乙酸脱卤酶(FAcD)RPA1163可以通过将消旋底物2-氟-2-苯基乙酸或2-氟-3-苯基丙酸中的S型脱氟得到(R)-2-羟基-2-苯基乙酸或(R)-2-羟基-3-苯基丙酸，而保留未反应的(R)-2-氟-2-苯基乙酸或(R)-2-氟-3-苯基丙酸，从而实现动力学拆分。虽然该酶为脱卤酶，但目前相关报道只证明该酶作用于氟化底物，并未见氟乙酸脱卤酶可以用于催化氯化、溴化等其他卤代底物的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是现有的野生型氟乙酸脱卤酶无法用于催化溴化底物，尤其是2-溴丁酸底物的缺陷，因此本专利技术提供一种氟乙酸脱卤酶突变体以及其在制备(R)-2-溴丁酸中的应用。利用本专利技术的氟乙酸脱卤酶突变体制备(R)-2-溴丁酸时，生产成本低，立体选择性高，利于工业化生产。本专利技术所用的野生型氟乙酸脱卤酶来源是Rhodopseudomonaspalustris，具体序列如序列表中SEQIDNO.1所示。该野生型氟乙酸脱卤酶由304个氨基酸残基组成，申请人经实验发现，该野生型氟乙酸脱卤酶无法用于催化2-溴丁酸。本专利技术人针对该底物对上述野生型酶的不同氨基酸位点进行了饱和突变的大量筛选，发现H155、W156、Y219位点的部分突变体可以用于催化底物2-溴丁酸。进而对这些位点进行组合突变并构建突变体文库，从中筛选出本专利技术所述的野生型氟乙酸脱卤酶。本专利技术解决上述技术问题的技术方案之一是：一种氟乙酸脱卤酶突变体，其中所述氟乙酸脱卤酶突变体的序列包括将SEQIDNO.1所示的第155位氨基酸残基H、和/或第156位氨基酸残基W进行突变后的序列；所述氟乙酸脱卤酶突变体具有催化溴化底物、尤其是2-溴丁酸底物的活性。较佳地，所述氟乙酸脱卤酶突变体的序列包括将SEQIDNO.1所示的第155位氨基酸残基H、和/或第156位氨基酸残基W突变为天然氨基酸残基后的序列。更佳地，所述氟乙酸脱卤酶突变体的序列还包括将SEQIDNO.1所示的第219位氨基酸残基Y突变为天然氨基酸残基后的序列。进一步更佳地，所述第155位氨基酸残基H突变为A、C、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、S、T、V或W，优选突变为I、N、V、F、L、Q、A、C、M、P、T或W，更优选突变为I、N或V；和/或，第156位氨基酸残基W突变为A、C、D、F、G、I、L、M、P、R、S、T、V或Y，优选突变为A、C、D、F、G、I、L、M、R、S、T或Y，更优选突变为F、M、R、S或T；和/或，第219位氨基酸残基Y突变为疏水性氨基酸残基，优选突变为F、L或M。较佳地，所述第155位氨基酸残基H突变为V，或第156位氨基酸残基W突变为M、T、C、F、S、V、A或L。上述大写英文单字母代表如本领域技术人员熟知的氨基酸，根据本专利技术，在此代表的是相应的氨基酸残基。较佳地，所述氟乙酸脱卤酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15、SEQIDNO.17、SEQIDNO.19、SEQIDNO.21、SEQIDNO.23、SEQIDNO.25、SEQIDNO.27、SEQIDNO.29、SEQIDNO.31、SEQIDNO.33、SEQIDNO.35、SEQIDNO.37、SEQIDNO.39、SEQIDNO.41、SEQIDNO.43、SEQIDNO.45、SEQIDNO.47、SEQIDNO.49、SEQIDNO.51、SEQIDNO.53、SEQIDNO.55、SEQIDNO.57、SEQIDNO.59、SEQIDNO.61、SEQIDNO.63、SEQIDNO.65、SEQIDNO.67、SEQIDNO.69、SEQIDNO.71、SEQIDNO.73、SEQIDNO.75、SEQIDNO.77、SEQIDNO.79、SEQIDNO.81、SEQIDNO.83、SEQIDNO.85、SEQIDNO.87、SEQIDNO.89、SEQIDNO.91、SEQIDNO.93、SEQIDNO.95、SEQIDNO.97、SEQIDNO.99、SEQIDNO.101、SEQIDNO.103、SEQIDNO.105、SEQIDNO.107、SEQIDNO.109、SEQIDNO.111、SEQIDNO.113、SEQIDNO.115、SEQIDNO.117、SEQIDNO.119、SEQIDNO.121、SEQIDNO.123、SEQIDNO.125、SEQIDNO.127、SEQIDNO.129所示；更佳地，编码所述氟乙酸脱卤酶突变体的核苷酸序列如SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16、SEQIDNO.18、SEQIDNO.20、SEQIDNO.22、SEQIDNO.24、SEQIDNO.26、SEQIDNO.28、SEQIDNO.30、SEQIDNO.32、SEQIDNO.34、SEQIDNO.36、SEQIDNO.38、SEQIDNO.40、SEQIDNO.42、SEQIDNO.44、SEQIDNO.46、SE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氟乙酸脱卤酶突变体，其特征在于，所述氟乙酸脱卤酶突变体的序列包括将SEQID NO.1所示的第155位氨基酸残基H、和/或第156位氨基酸残基W进行突变后的序列；所述氟乙酸脱卤酶突变体具有催化溴化底物、尤其是2-溴丁酸底物的活性。/n

【技术特征摘要】
20180605 CN 20181057756161.一种氟乙酸脱卤酶突变体，其特征在于，所述氟乙酸脱卤酶突变体的序列包括将SEQIDNO.1所示的第155位氨基酸残基H、和/或第156位氨基酸残基W进行突变后的序列；所述氟乙酸脱卤酶突变体具有催化溴化底物、尤其是2-溴丁酸底物的活性。


2.如权利要求1所述的氟乙酸脱卤酶突变体，其特征在于，所述氟乙酸脱卤酶突变体的序列包括将SEQIDNO.1所示的第155位氨基酸残基H、和/或第156位氨基酸残基W突变为天然氨基酸残基后的序列；较佳地，所述氟乙酸脱卤酶突变体的序列还包括将SEQIDNO.1所示的第219位氨基酸残基Y突变为天然氨基酸残基后的序列。


3.如权利要求1或2所述的氟乙酸脱卤酶突变体，其特征在于，所述第155位氨基酸残基H突变为A、C、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、S、T、V或W，和/或，第156位氨基酸残基W突变为A、C、D、F、G、I、L、M、P、R、S、T、V或Y，和/或，第219位氨基酸残基Y突变为疏水性氨基酸残基；
较佳地，所述第155位氨基酸残基H突变为I、N、V、F、L、Q、A、C、M、P、T或W，和/或，第156位氨基酸残基W突变为F、M、R、S、T、G、L、A、C、D、I或Y，和/或，第219位氨基酸残基Y突变为F、L或M；
更佳地，所述第155位氨基酸残基H突变为I、N或V，和/或，第156位氨基酸残基W突变为F、M、R、S或T，和/或，第219位氨基酸残基Y突变为F、L或M。


4.如权利要求1～3任一项所述的氟乙酸脱卤酶突变体，其特征在于，所述第155位氨基酸残基H突变为V，
或第156位氨基酸残基W突变为M、T、C、F、S、V、A或L。


5.如权利要求1～4任一项所述的氟乙酸脱卤酶突变体，其特征在于，所述氟乙酸脱卤酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15、SEQIDNO.17、SEQIDNO.19、SEQIDNO.21、SEQIDNO.23、SEQIDNO.25、SEQIDNO.27、SEQIDNO.29、SEQIDNO.31、SEQIDNO.33、SEQIDNO.35、SEQIDNO.37、SEQIDNO.39、SEQIDNO.41、SEQIDNO.43、SEQIDNO.45、SEQIDNO.47、SEQIDNO.49、SEQIDNO.51、SEQIDNO.53、SEQIDNO.55、SEQIDNO.57、SEQIDNO.59、SEQIDNO.61、SEQIDNO.63、SEQIDNO.65、SEQIDNO.67、SEQIDNO.69、SEQIDNO.71、SEQIDNO.73、SEQIDNO.75、SEQIDNO.77、SEQIDNO.79、SEQIDNO.81、SEQIDNO.83、SEQIDNO.85、SEQIDNO.87、SEQIDNO.89、SEQIDNO.91、SEQIDNO.93、SEQIDNO.95、SEQIDNO.97、SEQIDNO.99、SEQIDNO.101、SEQIDNO.103、SEQIDNO.105、SEQIDNO.107、SEQIDNO.109、SEQIDNO.111、SEQIDNO.113、SEQIDNO.115、SEQIDNO.117、SEQIDNO.119、SEQIDNO.121、SEQIDNO.123、SEQIDNO.125、SEQIDNO.127、SEQIDNO.129所示；较佳地，所述氟乙酸脱卤酶突变体的核苷酸序列如SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16、SEQIDNO.18、SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：瞿旭东，程占冰，丁少南，徐艳冰，黄瑶，
申请(专利权)人：上海弈柯莱生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31