多肽，分离的其多核苷酸，以及包含多肽的添加剂、其用途及方法技术

以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，其是具有选自SEQ ID No.1‑15的氨基酸序列或其功能性变体的水解酶，其中在所述功能性变体与至少一个所述氨基酸序列之间的序列同一性为至少40％；以及包含所述多肽的添加剂；以及编码所述多肽的分离的多核苷酸；以及用于用所述多肽来以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的方法。

Polypeptides, polynucleotides, additives containing polypeptides, uses and methods thereof

A polypeptide hydrolyzing zearalenone and / or at least one zearalenone derivative is a hydrolase having an amino acid sequence or a functional variant thereof selected from SEQ ID no.1-15, wherein the sequence identity between the functional variant and at least one amino acid sequence is at least 40%; and an additive including the polypeptide; and encoding the polypeptide The isolated polynucleotide of the polypeptide; and a method for hydrolyzing zearalenone and / or at least one zearalenone derivative with the polypeptide.

【技术实现步骤摘要】
多肽，分离的其多核苷酸，以及包含多肽的添加剂、其用途及方法本申请是申请日为2014年8月27日、申请号为201480055221.7、专利技术名称为“用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，分离的其多核苷酸，以及包含多肽的添加剂、其用途及方法”的专利技术专利申请的分案申请。本专利技术涉及用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，编码此类多肽的分离的多核苷酸，以及包含此类多肽的添加剂，还涉及此类多肽的用途，以及涉及用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的方法。真菌毒素是丝状真菌产生的次生代谢物。其一个重要的代表是世界范围传播的玉米赤霉烯酮(ZEN)(以前称为F-2毒素)，其由许多镰孢菌真菌产生。这些真菌尤其侵染栽培植物，例如各种各样的谷类，其中真菌侵染通常出现在收获之前，其中真菌生长或真菌毒素产生可以在收获之前发生，或者在不适当的贮藏的情况下也可以在收获之后发生。FAO估计，在世界范围内25％的农产品被真菌毒素污染，这导致巨大的经济损失。在一项最近在世界范围内进行的研究中，从2009年1月至2011年12月分析了总共23,781个样品，其中81％经测试为对于至少一种真菌毒素来说阳性和45％对于ZEN来说阳性。可以在世界的所有地区中，同样地在所有经测试的谷物类别和饲料类别，例如玉米、大豆粉、小麦、麦麸、DDGS(干酒糟)中，以及在预制饲料混合物中，以直至100％的频率发现ZEN。ZEN是一种非甾类的、雌激素的、大环的、通过聚酮化合物物质代谢途径合成的内酯，其具有下述结构式：和IUPAC命名名称“(2E,11S)-15,17-二羟基-11–甲基-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-1(18),2,14,16-四烯-7,13-二酮”。然而，在自然界中还存在有许多ZEN衍生物，其通过ZEN的酶促或化学修饰而形成。关于此的例子为糖苷式的或含硫酸酯的ZEN缀合物，其由真菌、植物或哺乳动物代谢来形成；以及ZEN代谢物，其尤其在人或动物机体中形成。在下文中，ZEN衍生物是指在自然界中存在的或者通过化学或生物化学合成而制备的ZEN缀合物或ZEN代谢物，但特别地是指α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL；(2E,7R,11S)-7,15,17-三羟基-11-甲基-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-1(18),2,14,16-四烯-13-酮)、β-玉米赤霉烯醇(β-ZEL；(2E,7S,11S)-7,15,17-三羟基-11-甲基-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-1(18),2,14,16-四烯-13-酮)、α-玉米赤霉醇(α-ZAL；(7R,11S)-7,15,17-三羟基-11-甲基-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-1(18),14,16-三烯-13-酮)、β-玉米赤霉醇(β-ZAL；(7S,11S)-7,15,17-三羟基-11-甲基-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-1(14),15,17-三烯-13-酮)、玉米赤霉烯酮-14-硫酸酯(Z14S；[(2E,11S)-15-羟基-11-甲基-7,13-二氧代-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-1(18),2,14,16-四烯-17-基]硫酸氢酯)、玉米赤霉烯酮-14-糖苷(Z14G；(2E,11S)-15-羟基-11-甲基-17-[(3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢吡喃-2-基]氧基-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-1(18),2,14,16-四烯-7,13-二酮)以及玉米赤霉酮(ZAN；(11S)-15,17-二羟基-11-甲基-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-1(18),14,16-三烯-7,13-二酮)。ZEN，同样地还有ZEN衍生物，尤其是α-ZEL、β-ZEL、Z14S、α-ZAL、β-ZAL、Z14G和ZAN，由于其高的化学和物理稳定性而还可以在经加工的食品或饲料例如面包或啤酒中检测到。ZEN与雌激素受体结合并且可以引起激素紊乱，其中它在经口摄取后立即被吸收，并且被哺乳动物转变为两个立体异构的代谢物，分别为α-ZEL和β-ZEL。在此，例如α-ZEL，还有α-ZAL或ZAN具有比ZEN强得多的动情效应。经缀合的ZEN衍生物有时具有比ZEN低的雌激素活性，然而如果情况可能，ZEN可以从这些ZEN衍生物中重新被释放到消化道中。虽然ZEN具有相对低的急性毒性并且具有直至20,000mg/kg体重的口服LD50值，但是在较长期摄入的情况下在动物或人中出现亚急性和/或亚慢性的毒性效应，例如致畸形的、致癌的、动情的和免疫抑制的效应。被ZEN污染的饲料导致哺乳动物中的发育障碍，其中猪，特别是幼猪对于ZEN是极其敏感的。超过0.5ppm的在饲料中的ZEN浓度导致发育障碍，其中例如超过1.5ppm的浓度可以导致猪中的超雌激素活性，和12ppmZEN的浓度被认为对牛中的流产负责。由于玉米赤霉烯酮通过粘膜，特别是通过胃粘膜，但也通过口腔粘膜被迅速吸收，因此立即的和尤其是定量的钝化是必要的。在ZEN的口服给药后30分钟已经可以在血液中检测到它们。在这种情况下，使用经分离的针对微生物的酶具有优点，例如更高的比活性或更快的作用。由于ZEN的有害效应，因而在欧盟存在有在食品中的强制性的ZEN上限以及对于在饲料中的ZEN上限的推荐(ECNO:1881/2006)。为了减少食品或饲料的ZEN污染的最初策略是限制真菌生长，例如通过遵循“良好的农业实践经验”。这尤其包括，种子没有害虫和真菌侵染，或者及时从田地中移除农业废料。此外，还可以通过使用杀真菌剂来减少田地上的真菌生长。在收获之后，应当将收获物储藏在低于15％的残留水分含量和低的温度下，以阻止真菌生长。同样地，应当在再加工之前去除由于真菌侵染而被污染的物料。尽管有着这一系列措施，但I.Rodriges和K.Naehrer(2012)仍然报道了，即使在具有最高农业标准的地区，例如USA和中欧，在2009年至2011年中，分别有29％和39％的经测试的玉米样品被ZEN污染。用于从饲料或食品中去除ZEN的其他可能性为真菌毒素的吸附或转化。为此所必需的是，真菌毒素与吸附剂的结合在宽的pH范围内是强的且特异的，并且在胃肠区域内的整个消化过程中保持稳定。虽然对于黄曲霉毒素可以有效地使用几种非生物吸附剂，例如活性炭、硅酸盐或合成的聚合物，例如消胆胺，但是它们用于其他真菌毒素则受到限制。吸附剂的主要缺点是其他有时候对于营养供给来说必需的分子的非特异性结合。在文献中同样也描述了生物吸附剂，例如酵母或酵母提取物，然而生物吸附剂像非生物吸附剂一样也具有类似的限制。通过物理和化学处理来对ZEN进行解毒也受到限制。通过热处理，不能有效地使ZEN钝化，但是可以通过挤出和用氧化剂进行处理，例如在80℃下用10％的过氧化氢溶液处理16小时，来使ZEN含量降低83.9％。在饲料和食品的制备中挤出方法和氧化剂例如臭氧或过氧化氢的使用，由于高的成本、品质损失、有时候低的效率和低的特异性而受限。借助于微生物例如噬真菌毒素丝孢酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，所述玉米赤霉烯酮衍生物选自α-ZEL、β-ZEL、α-ZAL、β-ZAL、Z14G、Z14S和ZAN，其特征在于，所述多肽是具有SEQ ID No.13的氨基酸序列或其功能性变体的水解酶，其中在所述功能性变体与所述氨基酸序列之间的序列同一性为至少83％，/n其中所述多肽包含至少一个保守氨基酸序列区段或其功能性变体，其中所述氨基酸序列区段的功能性变体具有至少84％的序列同一性，并且所述至少一个保守氨基酸序列区段选自具有SEQ ID No.1的序列的氨基酸序列+89至+145或+223至+228，并且/n其中所述多肽具有至少0.01U/mg的比活性。/n

【技术特征摘要】
20130828 AT A667/20131.以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，所述玉米赤霉烯酮衍生物选自α-ZEL、β-ZEL、α-ZAL、β-ZAL、Z14G、Z14S和ZAN，其特征在于，所述多肽是具有SEQIDNo.13的氨基酸序列或其功能性变体的水解酶，其中在所述功能性变体与所述氨基酸序列之间的序列同一性为至少83％，
其中所述多肽包含至少一个保守氨基酸序列区段或其功能性变体，其中所述氨基酸序列区段的功能性变体具有至少84％的序列同一性，并且所述至少一个保守氨基酸序列区段选自具有SEQIDNo.1的序列的氨基酸序列+89至+145或+223至+228，并且
其中所述多肽具有至少0.01U/mg的比活性。


2.根据权利要求1的多肽，其特征在于，所述多肽包含至少一个保守氨基酸序列区段或其功能性变体，其中所述氨基酸序列区段的功能性变体具有至少92％的序列同一性，并且所述至少一个保守氨基酸序列区段为具有SEQIDNo.1的序列的氨基酸序列+223至+228。


3.根据权利要求2的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列区段的功能性变体具有至少98％的序列同一性。


4.根据权利要求1至3之一的多肽，其特征在于，所述多肽在至少一个选自下列的位置处具有关于SEQIDNo.1的氨基酸序列的至少一个突变：22、23、25、26、27、29、31、32、35、37、42、43、46、51、53、54、57、60、69、72、73、78、80、84、88、95、97、99、114、118、119、123、132、141、146、148、149、154、163、164、165、169、170、172、176、180、182、183、190、191、194、196、197、198、201、204、205、206、207、208、209、210、212、213、214、216、217、220、221、222、229、231、233、238、240、244、245、246、248、249、251、254、256、260、262、263、266、269、271、277、280、281、282、283、284、285、286、287、292、296、298、302、307、308、309、311、314、317、319、321、323、325和326。


5.根据权利要求1至3之一的多肽，其特征在于，所述多肽具有选自下列的关于SEQIDNo.1的氨基酸序列的至少一个突变：D22A、S23Q、S23L、N25D、I26V、F27Y、F27H、S29P、R31A、F32Y、R35K、R35Q、V37A、V42I、V43T、F46Y、S51E、S51D、D53G、N54M、N54R、L57V、L60I、S69G、P72E、V73A、A78S、N80H、F84Y、I88L、T95S、T97A、R99K、I114M、I118V、K119R、V123I、L132V、A141S、I146V、I146L、A148G、A149V、A154P、P163T、A164T、Y165C、Y165H、V169I、L170R、A172G、A176M、A176V、Y180F、D182T、F183Y、I190V、G191S、K194T、K194E、F196Y、V197C、V197R、E198R、E198S、K201D、K201G、P204S、P204A、A205S、K206P、A207M、M208A、Q209R、L210A、L210S、ΔP212、T213V、P214A、E216T、E216G、A217I、N220H、L221M、K222R、K222Q、G229A、A231V、F233W、F233Y、F233H、A238G、H240N、H240S、D244E、R245Q、M246L、S248T、S248N、S248G、Q249R、K251N、I254V、I256L、A260M、T262D、T262G、I263T、E266D、E269H、E269N、L271V、L277E、E280A、E280L、H281R、H281Q、A282V、Q283R、D284L、D284R、I285L、I286M、R287E、R287D、R292K、R292T、Q296A、Q296E、H298V、L302S、L307Q、F308S、D309A、A311P...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·弗鲁豪夫，M·萨姆海塞尔，M·费菲尔，D·摩尔，G·沙特兹迈尔，E·M·宾德，
申请(专利权)人：爱尔伯股份公司，
类型：发明
国别省市：奥地利;AT