一种鸡PTF1a基因重组蛋白、多克隆抗体制备方法技术

本发明专利技术属于多克隆抗体制备技术领域，具体涉及分子克隆、抗体制备技术领域，具体涉及一种鸡PTF1a基因重组蛋白、多克隆抗体的制备及纯化方法。本发明专利技术根据Genbank中Ptf1a基因设计具有高效扩增能力的特异性扩增Ptf1a基因的引物，制备出大小正确、纯度在85%左右的重组抗原蛋白，免疫日本大耳兔获得高效价抗血清，纯化得到浓度为10mg/ml，纯度为90%的特异性多克隆抗体，经WB检测与重组抗原在47kDa处有特异性识别，且条带单一，可以作为抗体用于WB检测鸡Ptf1a蛋白水平，为评估鸡胰腺外分泌发育情况，为鸡育种及功能性酶制剂添加提供参考。

【技术实现步骤摘要】
一种鸡PTF1a基因重组蛋白、多克隆抗体制备方法
本专利技术属于分子克隆、抗体制备
，具体涉及一种鸡PTF1a（Pancreasassociatedtranscriptionfactor1a）基因重组蛋白、多克隆抗体的制备及纯化方法。
技术介绍
腺泡细胞来源于胰腺干细胞PTF1a的表达，PTF1a是bHLH转录因子，最初在胰腺祖细胞中表达，之后存在于腺泡中。缺乏PTF1a会导致腺泡细胞形成受阻，PTF1a基因突变小鼠的分析显示，PTF1amRNA存在剂量阈值，该阈值使得胰腺的分化结果沿着指定的途径发育。PTF1amRNA剂量的减少导致早期胰腺前体细胞增殖减少，外分泌细胞分化受损。在斑马鱼中的研究表明，减少PTF1a表达会导致多能祖细胞分化形成内分泌部，而增加PTF1a表达使胰腺祖细胞分化形成腺泡的概率增加。因此，PTF1a可能具有双重作用，取决于其表达水平或活性。尽管在胰腺胚胎发育过程中积累了有关PTF1a功能和剂量的信息，但有关PTF1a在成熟胰腺中作用的认知仍然有限。PTF1a最初被发现是成熟腺泡细胞中淀粉酶和弹性蛋白酶等消化酶的转录调节因子。Krah等人研究表明成熟腺泡细胞中PTF1a的条件缺失导致导管化生，并使细胞对Kras转化高度敏感。最近的研究表明PTF1a在成熟腺泡中表达，诱导细胞周期抑制剂Cdkn1a（p21）的表达。因此，PTF1a的表达可能有助于改善成熟腺泡细胞的低增殖指数。但在家禽中，PTF1a基因鲜有报道。因此，Ptf1a是评估胰腺腺泡细胞功能成熟的重要标志物，对家禽育种及饲料添加剂应用具有指导意义。转录因子Ptf1a在体内以蛋白质分子的形式影响胰腺外分泌发育和功能成熟，研究表明Ptf1a基因受miRNA转录后调控影响，应用RT-PCR法检测Ptf1a基因mRNA转录水平与组织中蛋白水平无相关性，需要使用抗体来检测其蛋白含量。当前市售Ptf1a抗体多为人，小鼠，大鼠等动物，且与鸡同源性较差无法使用。因此急需鸡源Ptf1a抗体来测定组织中转录因子水平，从而应用评估鸡胰腺外分泌发育情况，为鸡育种及功能性酶制剂添加提供参考。
技术实现思路
针对目前在家禽研究领域中未有PTF1a基因相关研究的缺陷和问题，本专利技术提供一种鸡PTF1a基因重组蛋白、多克隆抗体的制备及纯化方法。本专利技术解决其技术问题所采用的方案是：一种用于扩增鸡PTF1a基因的引物组，碱基序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.22所示。本专利技术还提供一种鸡PTF1a基因重组蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.24。本专利技术还提供一种鸡PTF1a基因多克隆抗体制备方法，包括以下步骤：步骤一、设计引物进行PCR扩增，以PET-B2M为载体，以NotICpoI酶切位点进行载体与鸡PTF1a基因的连接得到重组质粒，并转化至感受态细胞中，将转化后的感受态细胞进行培养，选取阳性克隆抗体进行测序；步骤二、将测序正确的阳性克隆接种于LB中扩大培养，挑选含重组质粒的单菌落进行培养，超声破碎菌体，离心收集上清和沉淀，获得包涵体蛋白；步骤三、将将包涵体蛋白溶解、亲和纯化，测定重组蛋白纯度；步骤四、将重组蛋白进行三次动物免疫，末次免疫后10d采集动物血清抗原，对抗原进行效价检测、抗体纯化并对抗原进行WB检测。上述的鸡PTF1a基因多克隆抗体制备方法，步骤一中所用载体为pet-b2m，酶切位点为NotICpoI，感受态细胞为TOP10，质粒提取试剂盒为Axygen，PfuDNApolymerase为Lifetechnology，T4DNA连接酶为Fermentas。上述的鸡PTF1a基因多克隆抗体制备方法，步骤一中PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环。上述的鸡PTF1a基因多克隆抗体制备方法，所述抗体纯化是将获得的血清上样至预处理过的层析柱中，经洗杂、抗体洗脱、pH调节、样品浓缩、透析、层析柱洗涤进行纯化。上述的鸡PTF1a基因多克隆抗体制备方法，所述抗体洗脱使用0.1MPH3.0甘氨酸洗脱，收集洗脱物并用G250检测洗脱产物至不变蓝为止，反应60min。本专利技术的有益效果：1、本申请根据Genbank中Ptf1a基因CDS区序列设计具有高效扩增能力的特异性扩增Ptf1a基因的引物，制备出大小正确、纯度在85%左右的重组抗原蛋白，免疫日本大耳兔获得高效价抗血清，纯化得到浓度为10mg/ml，纯度为90%的特异性多克隆抗体，经WB检测与重组抗原在47kDa处有特异性识别，且条带单一，可以作为抗体用于WB检测鸡Ptf1a蛋白水平，为评估鸡胰腺外分泌发育情况，为鸡育种及功能性酶制剂添加提供参考。2、PTF1A是成熟腺泡细胞中淀粉酶和弹性蛋白酶等消化酶的转录调节因子，对腺腺泡细胞增殖和外分泌部发育起着重要的作用。本专利技术得到了鸡PTF1A蛋白的多克隆抗体，为之后进一步研究家禽中PTF1A的功能打下了重要的基础。以PTF1A蛋白为标志物可检测饲料添加剂对鸡内源消化酶分泌的影响，并为酶制剂等饲料添加剂的开发使用提供理论支持。附图说明图1为本专利技术重组菌体蛋白经超声破损离心后SDS-PAGE检测电泳图；其中，泳道1为PTF1A-PET-B2M大小47KD的重组蛋白上清液；泳道2为PTF1A-PET-B2M大小47KD的重组蛋白沉淀；泳道3为Marker：116/66.2/45/35/25/18.4/14.5（kDa）。图2为包涵体蛋白纯化以6M盐酸胍重悬、溶解、离心后上清液SDS-PAGE电泳检测图；其中，泳道1为Marker：116/66.2/45/35/25/18.4/14.5（kDa）；泳道2为PTF1A-PET-B2M大小47KD经10倍稀释的纯化抗原。图3为用稀释液将血清按1:2000,1:4000,1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000......进行倍比稀释（空白血清同比稀释做阴性对照），ELISA反应后酶标仪测定450nm处各孔k的吸光值检测图；其中，图3A兔子编号为G1343，血清滴度512K，OD抗血清/OD免前血≥2.1；图3B兔子编号为G1344，血清滴度1024K，OD抗血清/OD免前血≥2.1。图4为兔G1343/G1344抗体纯化SDS-PAGE电泳检测图；其中，泳道1为兔G1344纯化抗体经4倍稀释；泳道2为兔G1343纯化抗体经4倍稀释；泳道M为Marker:116/66.2/45/35/25/18.4/14.5(kDa)，剂量为5ul，浓度为0.1mg/ml。图5为纯化抗原与重组抗原Westernblot检测图。其中，M泳道为Marker:250/150/100/70/50/40/35/25/20/15(kDa)；泳道1为重组蛋白PTF1A50ng，免前抗体2ug/ml孵育；泳道2为重组蛋白PTF1A50ng，抗体G13432ug/ml孵育；泳道3为重组蛋白PTF1A50n本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于扩增鸡PTF1a基因的引物组，其特征在于：碱基序列如SEQ ID NO.1- SEQID NO.22所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于扩增鸡PTF1a基因的引物组，其特征在于：碱基序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.22所示。


2.一种鸡PTF1a基因重组蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.24。


3.一种鸡PTF1a基因多克隆抗体制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、设计引物进行PCR扩增，以PET-B2M为载体，以NotICpoI酶切位点进行载体与鸡PTF1a基因的连接得到重组质粒，并转化至感受态细胞中，将转化后的感受态细胞进行培养，选取阳性克隆抗体进行测序；
步骤二、将测序正确的阳性克隆接种于LB中扩大培养，挑选含重组质粒的单菌落进行培养，超声破碎菌体，离心收集上清和沉淀，获得包涵体蛋白；
步骤三、将将包涵体蛋白溶解、亲和纯化，测定重组蛋白纯度；
步骤四、将重组蛋白进行三次动物免疫，末次免疫后10d采集动物血清抗原，对抗原进行效价检测、抗体纯化并对抗原进行WB检测。


4.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁林，王明发，李万利，靳玮，易宝弟，王浩宇，
申请(专利权)人：河南省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41