重组禽流感亚单位疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及疫苗制备技术领域，尤其涉及重组禽流感亚单位疫苗及其制备方法。本发明专利技术通过保留H5亚型禽流感主要保护性抗原HA骨架中的头部结构，同时将疫苗H5的颈部区替换为经过结构生物学设计改造后的具有广谱免疫保护的流感HA颈部区，该颈部区在小鼠实验中证实可以保护不同H5的突变株并且对H7可提供广谱保护。

【技术实现步骤摘要】
重组禽流感亚单位疫苗及其制备方法
本专利技术涉及疫苗制备
，尤其涉及重组禽流感亚单位疫苗及其制备方法。
技术介绍
流感病毒(Influenzavirus)属于正粘病毒科，是单股负链分节段的RNA病毒。根据核蛋白(NP)和基质蛋白(M1)上抗原决定簇的不同，流感病毒可分为A、B、C、D四型，其中A型和B型可给人类的健康带来威胁，尤其是A型，每年因全球季节性流感和散发性流感而导致大约30万～50万人死亡，死亡率高达60％。按照流感病毒感染对象来说可将病毒分为人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等类群。禽流感是由禽流感病毒引起的一类人畜共患传染性疾病，属于甲型流感病毒，野生禽类是甲型流感病毒的天然宿主，根据流感病毒对禽类的致病力不同，分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。禽流感病毒(AIV)是由Perroncito(1878)于1878年在意大利首次报道的，此后又在世界上多个国家和地区被陆续发现。高致病力禽流感(HPAIV)已被国际兽疫局列为A类烈性传染病。至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2和H7N9亚型。自1905年禽流感病原被确认后，世界上暴发了多次由H5亚型、H7亚型引起的高致病力禽流感(HPAIV)，并有研究发现在自然界广泛流行的低致病力毒株(LPAIV)的HA基因发生突变后形成高致病力毒株，禽流感病毒通常对野禽不具有致病性，但跨物种传播时往往具有高致病性。因此对于任何一种形式的禽流感，包括在水禽和野鸟体内持续存在，偶尔传播给家禽导致低致病力禽流感的发生都是不容忽视的。目前HA蛋白广泛应用于亚单位苗的研发中，已有研究表明，在细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等多种表达系统中表达的HA蛋白均有活性，利用HA蛋白研制基因工程疫苗在禽流感防控中发挥着重要的作用。研究人员认为HA蛋白头部球状结构是禽流感主要的保护性抗原。HA抗体滴度的高低从某种程度上能够反映机体对于禽流感病毒的抵抗力。随着基因工程技术的飞速发展，研究人员将HA基因克隆至真核表达载体上，转化至真核生物或细胞中进行表达来获得流感亚单位疫苗，进一步完成对动物免疫的研究。范文辉等利用毕赤酵母表达系统表达纯化H5HA蛋白，将不同剂量的H5HA与不同佐剂联用后免疫试验动物，进行免疫效力的评价。试验结果表明，H5HA具有较好的免疫原性，可诱导SPF鸡产生较高水平的IgG，血凝抑制效价达1：64，病毒中和抗体效价为1：218，研究结果为H5亚型流感病毒亚单位疫苗的研制提供了理论支撑。周陈陈等人利用昆虫杆状病毒表达系统纯化的H7-HA蛋白免疫SPF鸡后进行攻毒保护试验，评价该蛋白作为免疫对SPF鸡的免疫保护效力，结果显示HA蛋白免疫组鸡只得到100％保护。研究表明以Sf9细胞表达的H-HA、L-HA重组蛋白配制成油乳剂疫苗免疫14日龄的SPF鸡。免疫后第14、21、28天翅下静脉采血，通过血凝抑制试验(HI)和ELISA试验检测抗体效价，结果表明免疫后的各组均能够刺激机体产生较高的抗体。在免疫后的第3、5、7、10天，经FCAS检测CD3+/CD4+和CD3+/CD8+T淋巴细胞亚群的变化规律和淋巴细胞转化试验。结果表明，2个重组蛋白组鸡的CD3+/CD4+和CD3+/CD8+T淋巴细胞亚群比例稍高于灭活疫苗组，淋巴细胞转化试验亦表明，2个重组蛋白组鸡的淋巴细胞转化效率略高于常规灭活疫苗组。以上结果表明，重组蛋白制备的疫苗能够刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，具有较好的免疫原性，综合效果略优于现有H5亚型禽流感灭活疫苗。但是，现有技术中的疫苗大多仅针对一种亚型，无法具有广谱性。通常具有多价疫苗是将多种病毒灭活或对多个片段分别重组后制备的疫苗。其生产成本较高，生产周期也较长。因此，进一步研发，生产成本低，能同时刺激机体产生针对多种亚型病毒的免疫力的禽流感疫苗具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供重组禽流感亚单位疫苗及其制备方法，该疫苗具有广谱的免疫性。本专利技术提供了HA亚单位，其具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。本专利技术提供了编码HA亚单位的核酸，其具有如SEQIDNO:2所示的序列。本专利技术提供了HA重组抗原，包括顺序连接的：信号肽片段、本专利技术所述的HA亚单位、凝血酶片段、三聚体标签和筛选标记。其中，信号肽片段的氨基酸序列为MKVKLLVLLCTFTATYA。HA亚单位的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。DQICIGYSANNSTEQVDTIMEKNVTVTQAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKDSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVKGLSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLAIGLRNSPQRETQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGLYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAVGKEFNKSERRMENLNKKVDDGFIDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKR凝血酶片段的氨基酸序列为LVPRGS。三聚体标签的氨基酸序列为GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLG。所述筛选标记为6×His标签，即HHHHHH。本专利技术中，所述HA重组抗原的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。ATMKVKLLVLLCTFTATYADQICIGYSANNSTEQVDTIMEKNVTVTQAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKDSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVKGLSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLAIGLRNSPQRETQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGLYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAVGKEFNKSERRMENLNKKV本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.HA亚单位，其具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.HA亚单位，其具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。


2.编码HA亚单位的核酸，其具有如SEQIDNO:2所示的序列。


3.HA重组抗原，包括顺序连接的：信号肽片段、权利要求1所述的HA亚单位、凝血酶片段、三聚体标签和筛选标记。


4.根据权利要求3所述的HA重组抗原，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。


5.编码HA重组抗原的核酸，其具有如SEQIDNO:4所示的序列。


6.NA亚单位，其具有如SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。


7.编码NA亚单位的核酸，其具有如SEQIDNO:6所示的序列。


8.NA重组抗原，包括顺序连接的：信号肽片段、筛选标签、四聚体标签、凝血酶片段和权利要求6所述的NA亚单位。


9.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：仝舟，杨佳，成志敏，邢潇，王洋，高山，高福，
申请(专利权)人：山西高等创新研究院，
类型：发明
国别省市：山西;14