本发明专利技术提供了一种包装重组流感病毒的重组载体和重组流感病毒及其构建方法和应用，涉及生物医药技术领域。本发明专利技术利用A型流感病毒八个基因片段为骨架包装出带有新型冠状病毒SARS‑CoV‑2表面刺突蛋白受体结合域（SARS‑CoV‑2_RBD）片段的重组流感病毒，此重组流感病毒可在复制过程中表达具有生物学活性和免疫原性的刺突蛋白受体结合区域RBD。本发明专利技术所述重组流感病毒rgH1N1（PR8）‑PA‑RBD可作为重组病毒类药物，用于2019新型冠状病毒肺炎（COVID‑19）的预防；也可作为体外SARS‑COV‑2 RBD等相关抗原表达和体内递呈系统。
【技术实现步骤摘要】
一种包装重组流感病毒的重组载体和重组流感病毒及其构建方法和应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种包装重组流感病毒的重组载体和重组流感病毒及其构建方法和应用。
技术介绍
流感病毒广泛流行于禽类，哺乳动物及人。宿主分布广，变异快，常给人类和动物养殖业如禽类和猪带来较大疾病负担。从病毒分类学讲，流感病毒属于有囊膜的RNA病毒，其RNA为负股，囊膜病毒基因组分节段。流感病毒基因组由八个分节段的线性基因片段构成（C型流感病毒只有七个基因片段），八个基因片共段编码十个蛋白，分别为：RNA依赖性RNA聚合酶（PB2，PB1，PA），形成核衣壳的核蛋白NP，基质膜蛋白（M1和M2），两个表面膜蛋白（血凝素HA和神经氨酸酶NA），非结构蛋白NS1和核出运蛋白NEP。病毒基因的转录和复制发生于宿主细胞核内，病毒组装和出芽形成于宿主细胞膜。两个不同流感病毒同时感染一个细胞时会发生基因重配。流感病毒通过其表面糖蛋白HA吸附宿主细胞膜上的唾液酸寡聚糖。病毒粒子被内吞后，HA在内吞小体中发生构象变化，促使膜融合发生，进而使病毒脱掉衣壳。之后核衣壳蛋白移至核小体附近，病毒RNA开始被转录。病毒RNA转录时通过病毒内切酶将宿主细胞异源mRNA的加帽5'-末端剪切掉，使之成为病毒RNA模板被病毒逆转录酶转录的引物。转录子终止于模板末尾15-22个碱基，这些寡聚核苷（U）序列作为加上多聚polyA信号。流感病毒为分节段RNA病毒，其病毒基因组在宿主细胞核内被复制好后出核并与粗面内质网内翻译加工修饰好的结构蛋白相遇，此时八条病毒RNA（vRNA）会被包装到一个成熟病毒粒子里然后出芽形成新的具有感染性的子代病毒。目前较为清晰流感病毒包装机制仍不清楚，但已有的研究表明病毒vRNA包装是选择性的，而非随机包装。八个基因片段中每个基因的3'和5'端基因序列作为不同片段的特异性包装信号可使病毒vRNA有序高效的包装到一个病毒粒子，形成子代感染性病毒颗粒。也有研究表明存在少于八个基因片段的病毒粒子，但此类病毒粒子数量少，感染力不确定。流感病毒在遗传进化过程中产生很多天然基因缺失或插入，但主要以缺失最为普遍。这些缺失或插入对病毒的致病性，宿主范围扩大，新宿主适应都有重要作用。基因缺失主要集中在NA基因和NS1基因，尤其是动物源性流感病毒在感染和适应新宿主的过程中会经常出现，且缺失的具体位置和数目在不同毒株之间会有所差异。插入主要出现在低致病性流感病毒变为高致病性流感病毒时，在HA基因的切割位点/GLF基序前插入多个碱性氨基酸，如RKKR等。此类HA蛋白多个碱性氨基酸的插入只出现在H5和H7亚型流感病毒中。流感病毒这些缺失和插入表明病毒的基因组在这些位置可以容忍变异，因此人们尝试通过缺失的位置改造流感病毒，如NS1基因缺失病毒等。以往的研究表明利用流感病毒作为载体表达外源蛋白都集中在A型流感病毒基因组出现天然缺失的位置，如神经氨酸酶基因（NA）和非结构蛋白1（NS1）。这些位置出现缺失即表明病毒可以容忍缺失变异，但可以插入的外源基因片段不宜过大，且无需改造3'和5'包装信号，即3'包装信号序列-病毒基因ORF-（2A）外源蛋白基因序列-5'包装信号序列。这样的重组病毒多用于报告病毒系统，即病毒表达GFP或者luciferase等，但是并不适合报告基因以外的较大的外源基因片段。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种包装重组流感病毒的重组载体和重组流感病毒及其构建方法和应用，所述重组流感病毒可在复制过程中表达具有生物学活性和免疫原性的外源蛋白，可作为免疫原，从而应用于免疫治疗中。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种包装重组流感病毒的重组载体，所述重组载体的结构包括：流感病毒PA序列、包装信号序列、2A序列、IL2信号肽序列和外源序列；所述重组载体以携带PolI和PolII的载体为基础载体。优选的，所述流感病毒包括A型流感病毒毒株。优选的，所述流感病毒毒株包括A/PuertoRico/8/1934（H1N1亚型）。优选的，所述包装信号序列包括5'端包装信号序列。优选的，所述包装信号序列包括CSPS优化序列，所述CSPS的优化序列包括SEQIDNO.4所示的序列。优选的，所述外源序列包括传染病病毒的基因片段或肿瘤细胞的基因片段。优选的，所述传染病病毒包括：流感病毒、乙肝病毒、艾滋病病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、EBV、HCMV、EV71、RSV、Ebola和NDV。优选的，所述冠状病毒包括MERS-CoV和SARS-CoV-2。优选的，当所述冠状病毒为SARS-CoV-2时，所述重组载体的结构包括：流感病毒PA序列-包装信号序列-2A序列-IL2信号肽序列-SARS-CoV-2RBD序列-CD80序列。本专利技术还提供了上述重组载体的构建方法，包括以下步骤：将所述流感病毒PA序列连接入线性化的基础载体上，得连接模板，利用in-fusion方法，依次将所述包装信号序列、2A序列、IL2信号肽序列和外源序列与所述连接模板进行连接，得所述重组载体。本专利技术还提供了一种重组载体的构建方法，包括以下步骤：将BsmBI线性化的pHW2000载体与源自A/PuertoRico/8/1934的PA基因进行in-fusion连接，得初级载体pHW2000-PR8_PA；（2）利用in-fusion方法依次将CSPS优化序列、2A序列、IL2信号肽序列、SARS-CoV-2RBD序列、CD80序列和PR8-PA基因包装信号序列连接到初级载体pHW2000-PR8_PA上，得到重组载体pHW2000-PR8_PA-RBD；所述SARS-CoV-2RBD序列包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；所述PR8-PA基因包装信号序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术还提供了一种重组流感病毒的构建方法，分别将流感病毒的HA基因、NA基因、PB2基因、PB1基因、NP基因、M基因和NS基因序列连接入线性化的基础载体，得7个初级载体，利用八质粒反向遗传系统，将所述初级载体和上述重组载体共同转染293T细胞的混合细胞，包装得重组流感病毒。优选的，在构建所述7个初级载体和所述重组载体时，利用相同的酶切位点线性化所述基础载体。优选的，所述酶切位点包括BsmBI。本专利技术还提供了利用上述构建方法构建得到的重组流感病毒。本专利技术还提供了上述重组流感病毒在制备病毒免疫治疗和/或抗体免疫治疗的药物或疫苗中的应用。本专利技术还提供了一种重组流感病毒rgH1N1（PR8）-PA-RBD的构建方法，包括以下步骤：（1）分别将BsmBI线性化的pHW2000载体与源自A/PuertoRico/8/1934的HA基因、NA基因、PB2基因、PB1基因、PA基因、NP基因、M基因和NS基因进行in-fusion连接，得初级载体pHW2000-PR8_HA、pHW2000-PR8_NA、pHW2000-PR8_PB本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种包装重组流感病毒的重组载体，其特征在于，所述重组载体的结构包括：流感病毒PA序列、包装信号序列、2A序列、IL2信号肽序列和外源序列；/n所述重组载体以携带Pol I和Pol II的载体为基础载体。/n
【技术特征摘要】
1.一种包装重组流感病毒的重组载体，其特征在于，所述重组载体的结构包括：流感病毒PA序列、包装信号序列、2A序列、IL2信号肽序列和外源序列；
所述重组载体以携带PolI和PolII的载体为基础载体。
2.权利要求1所述重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述流感病毒PA序列连接入线性化的基础载体上，得连接模板，利用in-fusion方法，依次将所述包装信号序列、2A序列、IL2信号肽序列和外源序列与所述连接模板进行连接，得所述重组载体。
3.一种重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将BsmBI线性化的pHW2000载体与源自A/PuertoRico/8/1934的PA基因进行in-fusion连接，得初级载体pHW2000-PR8_PA；
（2）利用in-fusion方法依次将CSPS优化序列、2A序列、IL2信号肽序列、SARS-CoV-2RBD序列、CD80序列和PR8-PA基因包装信号序列连接到初级载体pHW2000-PR8_PA上，得到重组载体pHW2000-PR8_PA-RBD；所述SARS-CoV-2RBD序列包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；所述PR8-PA基因包装信号序列如SEQIDNO.5所示。
4.一种重组流感病毒的构建方法，其特征在于，分别将流感病毒的HA基因、NA基因、PB2基因、PB1基因、NP基因、M基因和NS基因序列连接入线性化的基础载体，得7个初级载体，利用八质粒反向遗传系统，将所述初级载体和权利要求1所述重组载体共同转染293T细胞的混合细胞，包装得重组流感病毒。
5.利用权利要求4所述构建方法构建得到的重组流感病毒。
6.权利要求5所述重组流感病毒在制备病毒免疫治疗和/或抗体免疫治疗的药物或疫苗中的应用。
7.一种重组流感病毒rgH1N1（PR8）-PA-RBD的构建方法，包括以下步骤：（1）分别将BsmBI线性化的pH...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋文俊，卢帅，张东晖，李月，
申请(专利权)人：北京溯本源和生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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