一种监测新冠病毒刺突蛋白S1特异性CTLs功能的可视化小鼠模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种监测新冠病毒刺突蛋白S1特异性CTLs功能的可视化小鼠模型的构建方法及应用，属于动物模型构建技术领域。本发明专利技术首先构建了含真核启动子、刺突蛋白S1基因和荧光报告基因的重组表达载体，通过转染试剂将重组表达载体转染至小鼠肺脏中，S1基因和荧光报告基因在小鼠体内转录和翻译水平一致，当小鼠感染新冠病毒后，体内启动了免疫应答，产生特异性杀伤S1蛋白的细胞毒性T细胞对感染肺部细胞清除，荧光报告蛋白也会随S1蛋白一同被清除，可利用活体荧光成像系统实时监测小鼠体内荧光强度。因此，通过实时监测荧光强度实现评价小鼠体内CTLs功能强弱。本发明专利技术提供构建的可视化小鼠模型可用于新冠病毒的药物或疫苗筛选和评价。

【技术实现步骤摘要】
一种监测新冠病毒刺突蛋白S1特异性CTLs功能的可视化小鼠模型的构建方法及应用
本专利技术属于动物模型构建
，具体涉及一种监测新冠病毒刺突蛋白S1特异性CTLs功能的可视化小鼠模型的构建方法及应用。
技术介绍
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一个大型病毒家族，可引起感冒、中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。因此，基于小动物感染新型冠状病毒的动物模型开展体内病毒清除监测和靶向药物开发就变得尤为重要。新型冠状病毒刺突蛋白的S1段(SpikeS1)为病毒包膜的外段，是目前疫苗研发药物开发的主要靶标，提示研究人员可以通过体内刺突蛋白S1的表达水平来评价特异性CTLS的功能。但目前仍没有一种简便快捷的手段能够实现来实时无创的监测体内SpikeS1特异性CTLs的功能。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种体内监测新冠病毒刺突蛋白S1特异性CTLs功能的可视化小鼠模型的构建方法，为实时监测体内特异性CTLs对感染细胞的清除能力提供了可能。本专利技术的目的还在于提供一种体内监测新冠病毒刺突蛋白S1特异性CTLs功能的可视化小鼠模型在药物筛选中的应用。本专利技术提供了一种体内监测新冠病毒刺突蛋白S1特异性CTLs功能的可视化小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：1)将真核启动子、荧光报告基因和编码新冠病毒刺突蛋白S1的基因插入真核表达载体中，得到重组表达载体；2)将所述重组表达载体转染小鼠，得到可视化小鼠模型。r>优选的，步骤1)中所述真核启动子、荧光报告基因和编码新冠病毒刺突蛋白S1的基因以一个融合基因片段的形式插入真核表达载体中。优选的，所述荧光报告基因和编码新冠病毒刺突蛋白S1的基因之间用IRES片段连接。优选的，步骤1)中所述荧光报告基因包括萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶或高斯荧光素酶。优选的，步骤1)中所述编码新冠病毒刺突蛋白S1的基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。优选的，步骤1)中所述真核启动子包括CMV启动子、SV40启动子、T7启动子和PGK启动子。优选的，步骤2)中将所述重组表达载体转染小鼠的方法是将所述重组表达载体、转染试剂和等张葡萄糖溶液混合，经尾静脉注射靶向递送至小鼠体内。优选的，所述重组表达载体的质量、转染试剂的体积和等张葡萄糖溶液的体积比为18～22μg：3～3.5μL：100μL。优选的，所述转染试剂为jetPEI。本专利技术提供了所述构建方法得到的体内监测新冠病毒刺突蛋白S1特异性CTLs功能的可视化小鼠模型在筛选或评价治疗新冠病毒感染的药物或预防新冠病毒感染的疫苗中的应用。本专利技术提供了所述构建方法得到的体内监测新冠病毒刺突蛋白S1特异性CTLs功能的可视化小鼠模型在作为评价过继性细胞治疗的载体中的应用。本专利技术提供一种体内监测SpikeS1特异性CTLs功能的报告基因标记的小鼠模型的构建方法，首先构建了含真核启动子、编码刺突蛋白S1基因全长和荧光报告基因的重组表达载体，通过转染试剂将所述重组表达载体转染至小鼠肺脏中，编码刺突蛋白S1基因和荧光报告基因以融合基因的方式在小鼠体内转录表达，两者mRNA水平一致，翻译水平一致，实现在体内无差别的进行表达；随即小鼠体内启动针对刺突蛋白S1的免疫应答，即会产生特异性杀伤刺突S1蛋白的细胞毒性T细胞(CTLs)，CTLs在对感染的肺部细胞进行杀伤，清除刺突蛋白S1，此时荧光报告蛋白也会一同被清除，可利用活体荧光成像系统实时监测小鼠体内荧光强度。因此，通过实时监测Fluc的荧光强度即可实现对刺突蛋白被清除程度的量化，进而小鼠体内CTLs功能强弱。本专利技术建立了一种简便易行，稳定可重复的可视化小鼠模型，该模型可用于监测刺突蛋白S1特异性CTLs的清除功能。同时，本专利技术用成年小鼠混合转染试剂靶向递送方法建立小鼠模型，不需要特殊仪器，具有研究周期短、花费小、目的基因在肺脏特异长期稳定表达，且具有表达量高等优点，应用前景广阔。附图说明图1为本专利技术构建的重组表达载体pSpikeS1-IRES2-Fluc结构示意图；图2为本专利技术构建可视化小鼠模型验证结果，其中图2-A为利用jetPEI将重组质粒pSpikeS1-IRES2-Fluc定向转染至小鼠肺脏后Fluc的持续监测结果，图2-B为采用免疫荧光检测不同时间点SpikeS1表达量结果，图2-C为荧光报告基因表达量与SpikeS1表达量的相关性统计结果，其中图2-B中比例尺为100μm；图3为本专利技术建立的小鼠模型在DC疫苗治疗中的应用，其中图3-A：流程图；图3-B：小鼠肺脏活体成像结果；图3-C：采用免疫荧光检测不同处理组SpikeS1表达量结果；其中图3-C中比例尺为100μm；图4为本专利技术建立的小鼠模型在过继性输注SpikeS1特异性CTLs治疗中的应用，其中图4-A：实验流程图；图4-B：负载SpikeS1蛋白的DC疫苗免疫小鼠两次后，小鼠脾脏和淋巴结增殖情况；图4-C：重组质粒pSpikeS1-IRES2-Fluc定向转染至小鼠肺脏后，通过尾静脉输注B中SpikeS1特异性CTLs，活体成像实时检测CTLs对肺部感染细胞的清除功能；图4-D：对C中小鼠肺脏荧光值统计图。具体实施方式本专利技术提供了一种体内监测新冠病毒刺突蛋白S1特异性CTLs功能的可视化小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：1)将真核启动子、荧光报告基因和编码新冠病毒刺突蛋白S1的基因插入真核表达载体中，得到重组表达载体；2)将所述重组表达载体转染小鼠，得到可视化小鼠模型。本专利技术将真核启动子、荧光报告基因和编码新冠病毒刺突蛋白S1的基因插入真核表达载体中，得到重组表达载体。在本专利技术中，所述真核启动子、荧光报告基因和编码新冠病毒刺突蛋白S1的基因优选以一个融合基因片段的形式插入真核表达载体中。所述荧光报告基因和编码新冠病毒刺突蛋白S1的基因之间优选用IRES2片段连接，先后顺序不做具体限定。在本专利技术实施例中，所述融合基因片段为真核启动子-编码新冠病毒刺突蛋白S1的基因-IRES2-荧光报告基因。所述编码新冠病毒刺突蛋白S1的基因的核苷酸序列优选如SEQIDNO：1(GCTAGCGCCACCATGTTTGTGTTCCTGGTGCTGCTGCCACTGGTGTCCAGCCAGTGTGTGAACCTGACCACCAGGACCCAACTTCCTCCTGCCTACACCAACTCCTTCACCAGGGGAGTCTACTACCCTGACAAGGTGTTCAGGTCCTCTGTGCTGCACAGCACCCAGGACCTGTTCCTGCCATTCTTCAGCAATGTGACCTGGTTCCATGCCATCCATGTGTCTGGCACCAATGGCACCAAGAGGTTTGACAACCCTGTGCTGCCATTCAATGATGGAGTCTACTTTGCCAGCACAGAGAAGAGCAACATCATCAGGGGCTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体内监测新冠病毒刺突蛋白S1特异性CTLs功能的可视化小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)将真核启动子、荧光报告基因和编码新冠病毒刺突蛋白S1的基因插入真核表达载体中，得到重组表达载体；/n2)将所述重组表达载体转染小鼠，得到可视化小鼠模型。/n

【技术特征摘要】
1.一种体内监测新冠病毒刺突蛋白S1特异性CTLs功能的可视化小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将真核启动子、荧光报告基因和编码新冠病毒刺突蛋白S1的基因插入真核表达载体中，得到重组表达载体；
2)将所述重组表达载体转染小鼠，得到可视化小鼠模型。


2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤1)中所述真核启动子、荧光报告基因和编码新冠病毒刺突蛋白S1的基因以一个融合基因片段的形式插入真核表达载体中。


3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，所述荧光报告基因和编码新冠病毒刺突蛋白S1的基因之间用IRES片段连接。


4.根据权利要求1～3任意一项所述构建方法，其特征在于，步骤1)中所述荧光报告基因包括萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶或高斯荧光素酶。


5.根据权利要求1～3任意一项所述构建方法，其特征在于，步骤1)中所述编码新冠病毒刺突蛋白S1的基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

【专利技术属性】
技术研发人员：詹林盛，赵燕，周欠欠，孙苏静，王小慧，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11